стр. 1
(из 4 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>

Данный документ переведен и адаптирован Американским
международным союзом здравоохранения (АМСЗ) при
поддержке Агентства США по международному развитию
(АМР США). Настоящий документ входит в Библиотеку
Инфосети «Здоровье Евразии» www.eurasiahealth.org/.

Ресурсы «Здоровья Евразии» предоставляются бесплатно и могут
свободно распространяться. Электронную версию настоящего
документа можно размещать на других сайтах только для
некоммерческих целей, без изменения содержания, с обязательным
указанием Инфосети «Здоровье Евразии» в качестве источника,
уведомлением электронной почтой по адресу library@eurasiahealth.org
и включением ссылки на сайт «Здоровья Евразии»
(www.eurasiahealth.org). Взимать плату за доступ к материалам
«Здоровья Евразии» запрещается.

АМСЗ и «Здоровье Евразии» не отвечают за мнения, изложенные в
данном документе. Ответственность за интерпретацию и
использование этого материала всецело лежит на читателе. АМСЗ и
«Здоровье Евразии» не несут ответственности за какие бы то ни было
ошибки, пропуски и другие возможные проблемы, связанные с данным
документом.

Перевод осуществлён компанией EnRus (http://www.enrus.ru/),
Москва, 2005 г.




Другие материалы по ВИЧ/СПИДу можно найти на сайте
www.eurasiahealth.org/aids/eaknl
Глава 9. Исследование устойчивости ВИЧ
Ева Вольф

Появление устойчивых штаммов ВИЧ — одна из главных причин неэффективности антиретровирусной
терапии. Если возникает устойчивость к препаратам сразу нескольких групп, возможности выбора
значительно сокращаются, к тому же резервные схемы терапии в этих случаях нередко дают лишь
кратковременный эффект.
Быстрое развитие устойчивости обусловлено высокой скоростью репликации ВИЧ (ежедневно образуется
почти 10 млн новых вирусных частиц [Perelson 1996]), а также очень большой частотой ошибок репликации,
совершаемых обратной транскриптазой ВИЧ. Это приводит к высокой частоте мутаций и постоянному
образованию новых штаммов вируса даже в отсутствие лечения. Под давлением антиретровирусных
препаратов происходит селекция устойчивых штаммов, и они начинают преобладать (Drake 1993).

Методы исследования устойчивости
Для оценки чувствительности ВИЧ к антиретровирусным препаратам (или устойчивости к ним) существует
два метода — фенотипирование и генотипирование (Wilson 2003). В настоящее время выпускаются системы
для этих исследований, для генотипирования, например: HIV-1 TrueGene™ (изготовитель — Bayer
Healthcare Diagnostics), ViroSeq™ (Celera Diagnostics/Abbott Laboratories), virco®Type HIV-1, (Virco),
GenoSure (Plus)™ (LabCorp) и GeneSeq™ (Virologic); для фенотипирования: Antivirogram® (Virco),
PhenoSense™ (ViroLogic), Phenoscript™ (VIRalliance).
Стоимость исследования колеблется в зависимости от лаборатории и используемой системы и составляет от
350 до 500 евро для генотипирования и примерно вдвое больше для фенотипирования. Применение обоих
методов в некоторой степени ограничено их порогом чувствительности: если вирусная нагрузка составляет
менее 500—1000 мл–1, оценить устойчивость вируса зачастую не удается.
Фенотипирование
С помощью фенотипирования можно получить непосредственную количественную оценку
чувствительности вируса к препаратам. При этом оценивают репликацию вируса в культурах клеток с
возрастающими концентрациями антиретровирусных препаратов и сравнивают с репликацией дикого
штамма вируса (контроля).
Чувствительность вируса к препарату оценивают по ПК50 (концентрации препарата, которая подавляет
репликацию вируса на 50%). Затем вычисляют отношение ПК50 исследуемого штамма к ПК50 контроля и
сопоставляют полученную величину с пороговой. Если полученная величина меньше пороговой, штамм
считают чувствительным, больше — устойчивым. Таким образом, знание пороговых величин очень важно
для интерпретации результатов.
На сегодня таких пороговых величин три. Техническая пороговая величина предусматривает
методологические расхождения исследований и составляет примерно 2,5. Биологическая пороговая величина
учитывает индивидуальные различия штаммов у пациентов, ранее не получавших антиретровирусных
средств; эта величина немного выше технической, однако предсказать клинический ответ на препарат по
ней нельзя. Клиническая пороговая величина отражает диапазон ПК50, при котором возможно подавление
репликации вируса.
В отношении ингибиторов протеазы (ИП) следует учитывать, в каких клинических исследованиях получены
соответствующие клинические пороговые величины: в исследованиях ИП, усиленных ритонавиром или не
усиленных им. При усилении ритонавиром концентрации препарата могут превышать некоторые уровни
устойчивости.
Недостатки фенотипирования включают длительность и дороговизну исследования.
Генотипирование
Генотипирование позволяет выявить мутации, которые приводят к устойчивости ВИЧ. Это можно сделать
при прямом определении амплифицированной нуклеотидной последовательности ВИЧ или с помощью
гибридизации с олигонуклеотидами дикого или мутантного штамма вируса. Генотипирование способно
выявить только те мутантные штаммы, которые численность которых составляет не менее 20—30%. Кроме
того, этот метод дает лишь косвенную оценку лекарственной устойчивости. Мутации, снижающие
чувствительность вируса, подробно описаны для большинства антиретровирусных препаратов, однако из-за
большого разнообразия профилей устойчивости и существования компенсаторных мутаций трактовать
степень устойчивости к конкретным препаратам довольно сложно.
Анализ генотипической устойчивости основан на корреляции генотипа и фенотипа. Данные о такой
корреляции добываются в исследованиях in vitro, клинических наблюдениях и двойном тестировании
(выяснении фенотипической устойчивости у штаммов с выявленными мутациями).
Один из методов определения фенотипа по генотипу — составление так называемого «виртуального
фенотипа» (например, с использованием VirtualPhenotype™): интерпретация выявленных мутаций с
помощью большой базы данных генотипов и соответствующих им фенотипов. В этой базе данных проводят
поиск штаммов с генотипами, соответствующими генотипу выделенного у пациента штамма. Подсчитав
среднее значение ПК50 этих штаммов, можно определить вероятный фенотип штамма пациента.
Для интерпретации выявленных при генотипировании мутаций широко используются различные
алгоритмы, составленные группами специалистов на основе выявленных в литературе и клинических
наблюдениях закономерностей, например, составленные французской группой исследования устойчивости
AC11 при Национальном агентстве исследований в области СПИДа (ANRS).
Кроме того, для предсказания фенотипической лекарственной устойчивости используются различные
автоматизированные системы, например с использованием дерева решений и поддерживающих векторных
машин (например, система «geno2pheno») (Beerenwinkel 2003).
Некоторые наиболее важные базы данных о профилях устойчивости и интерпретации результатов
генотипирования открыты для бесплатного доступа в интернете:
Стэнфордская база данных: http://hiv.net/link.php?id=24
Лос-Аламосская база данных: http://hiv.net/link.php?id=25
База данных «geno2pheno»: http://hiv.net/link.php?id=26.
Интерпретация генотипической лекарственной устойчивости ВИЧ – ANRS AC11:
http://hiv.net/link.php?id=138
Кроме того, руководства по интерпретации результатов генотипирования выпускают и производители
соответствующих систем, например, Virco для систем VirtualPhenotype™ и virco®Type HIV-1, Bayer
Healthcare Diagnostics для TruGene™ и Virology Networks для Retrogram™.
Рассматривая генотипическую устойчивость, основное внимание мы уделим мутациям генов обратной
транскриптазы и протеазы ВИЧ и гена env, кодирующего gp41, а также соответствующим профилям
устойчивости, возникающим в ходе лечения.
Большинство данных получено у пациентов с вирусом подтипа B (им инфицировано 12% ВИЧ-
инфицированных в мире). Однако патогенез и характер устойчивости у разных подтипов вируса могут
отличаться. Сегодня устойчивость изучается и у других подтипов вируса (Van de Vijver 2004).

Основные положения
В нуклеотидной последовательности генома ВИЧ группы из трех нуклеотидов — кодоны — определяют ту
или иную аминокислоту в структуре вирусных белков. Мутации обозначают числом, соответствующим
порядковому номеру кодона, и двумя буквами. Перед числом ставится буква, соответствующая кодируемой
данным кодоном аминокислоте у дикого штамма вируса. Буква после числа соответствует аминокислоте,
кодируемой мутантным кодоном.
Механизмы устойчивости
Нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ) становятся биологически
активными только после превращения в трифосфат. Фосфорилирование аналогов нуклеотидов проходит в
два этапа вместо трех. Фосфорилированные НИОТ конкурируют с природными
дезоксирибонуклеозидтрифосфатами (нуклеозидами). Встраивание фосфорилированных НИОТ в
провирусную ДНК обрывает ее дальнейший синтез.
Устойчивость к НИОТ определяется двумя основными механизмами (De Mendoza 2002). При первом в
результате мутации создается стерическое препятствие распознаванию обратной транскриптазой различий
между нуклеозидами и их аналогами; в результате вместо НИОТ в вирусную ДНК встраиваются
нуклеозиды. Такой механизм имеет место, например, при мутациях M184V, Q151M, L74V и K65R (Naeger
2001, Clavel 2004). Второй механизм — фосфоролиз АТФ или пирофосфата, в результате которого из
растущей цепи ДНК элиминируется уже встроенный НИОТ. Этот механизм опосредуется мутациями M41L,
D67N, K70R, L210W, T215Y и K219Q (Meyer 2000). Фосфоролиз приводит к перекрестной устойчивости к
различным НИОТ, причем устойчивость к зидовудину и ставудину больше, чем к абакавиру, к абакавиру
больше, чем зальцитабину, а к диданозину больше, чем к ламивудину.
Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ) также ингибируют вирусную
обратную транскриптазу (ОТ). ННИОТ — маленькие молекулы, которые связываются с гидрофобным
карманом вблизи с каталитическим доменом обратной транскриптазы. Мутации области связывания
снижают аффинность ННИОТ к ОТ и тем самым приводят к неэффективности лечения.
Ингибиторы протеазы (ИП) препятствуют расщеплению протеазой вирусного полипротеина gal-pol
(предшественника вирусных белков) и тем самым приводят к образованию незрелых вирусных частиц, не
способных инфицировать другие клетки. Устойчивость к ингибиторам протеазы обычно развивается
медленно, при накоплении нескольких мутаций — преодолении так называемого генетического барьера. В
отношении ингибиторов протеазы различают первичные (большие) и вторичные (малые) мутации.
Первичные мутации накапливаются на раннем этапе развития устойчивости к препарату и затрагивают
активную область фермента-мишени (протеазы ВИЧ), снижая способность ингибитора протеазы
связываться с этим ферментом. Первичные мутации могут также приводить к снижению активности
протеазы. Вторичные мутации не затрагивают активную область фермента и обычно возникают позже
первичных. Они компенсируют снижение жизнеспособности вируса, вызванное первичными мутациями
(Johnson 2004). Однако разграничение первичных и вторичных мутаций позволяет лишь грубо оценить
степень устойчивости вируса.
Ингибиторы слияния отличаются от НИОТ, ННИОТ и ИП тем, что не блокируют репликацию ВИЧ внутри
инфицированной клетки, а предотвращают проникновение ВИЧ в клетки-мишени. Первый этап
проникновения вируса в клетку начинается, когда гликопротеид внешней оболочки ВИЧ gp120 связывается
с рецепторами клетки-мишени: рецептором CD4 и хемокиновым корецептором CCR5 или CXCR4. После
связывания gp120 c рецептором CD4 и хемокиновым корецептором происходят конформационные
изменения трансмембранного гликопротеида gp41, которые обеспечивают слияние вирусной и клеточной
мембран и тем самым позволяют ВИЧ проникнуть в клетку.
Ингибитор слияния T-20 (энфувиртид) — синтетический пептид, который ингибирует конформационные
изменения gp41, необходимые для слияния вируса с клетками хозяина. Замена одной аминокислоты в gp41
способна снизить эффективность энфувиртида.
Передача устойчивых штаммов ВИЧ
Распространенность мутаций устойчивости у пациентов, не получавших антиретровирусных препаратов, в
разных регионах различается. В европейском кооперированном исследовании, включавшем более 1600
пациентов с впервые диагностированной ВИЧ-инфекцией, распространенность первичных мутаций
устойчивости в 1996—2002 гг. составила около 10%. Устойчивость обнаруживалась преимущественно у
недавно инфицированных лиц с вирусом подтипа B (Wensing 2003). Из 371 штамма, выделенного у не
получавших антиретровирусных средств пациентов в 40 городах США, хотя бы одна мутация устойчивости
была обнаружена у 14% пациентов. (Ross 2004). В исследованиях, проведенных в Сан-Франциско и
Испании, распространенность устойчивости у пациентов с острой или ранней бессимптомной стадиями
инфекции была еще выше — 26% и 19% соответственно (Grant 2003, de Mendoza 2003).
Клиническое значение первичных мутаций, уже имеющихся к началу лечения, несомненно: эти мутации
могут ограничивать выбор терапии. С другой стороны отмечено, что у пациентов, не получавших
антиретровирусных средств, они не всегда влияют на результаты лечения (Hicks 2003, Little 2002, Hanna
2001, Balotta 1999). При тщательном рассмотрении всех исходных мутаций устойчивости первичный успех
лечения часто достижим. В ретроспективном исследовании, включавшем 202 пациента, показано, что в тех
случаях, когда лечение начинали, не располагая сведениями о лекарственной устойчивости, у пациентов с
исходными мутациями ответ на лечение развивался медленнее, а риск неудачи лечения был выше (Little
2002).
Клинические исследования
Клиническая польза оценки устойчивости до замены схемы терапии была подтверждена в проспективных
контролируемых исследованиях — как в отношении фенотипирования (Cohen 2000), так и генотипирования
(Durant 1999; Baxter 1999; Tural 2001). У пациентов, чьи лечащие врачи получили информацию об
имеющихся мутациях до смены терапии, удалось добиться большего снижения вирусной нагрузки, чем у
пациентов, у которых профиль вирусной устойчивости не был известен.

Интерпретация генотипической устойчивости
НИОТ
К некоторым НИОТ (например, ламивудину) и ННИОТ выраженная устойчивость может появиться уже
после одиночной мутации (Havlir 1996, Schuurman 1995). Поэтому такие препараты следует назначать
только в составе высокоактивных схем терапии. Однако мутация устойчивости к ламивудину M184V
снижает и способность вируса к репликации (жизнеспособности вируса) на 40—60% (Sharma 1999, Miller
2003). Несмотря на раннее появление мутации M184V, через 52 недели монотерапии ламивудином вирусная
нагрузка оставалась на 0,5 log ниже, чем изначальная (Eron 1995). При монотерапии ламивудином
ухудшение иммунологических и клинических показателей происходит позже, чем при отмене лечения
(Castagna 2004).
Эмтрицитабин (FTC) — препарат из группы НИОТ, одобренный в 2003 г. Для него характерен тот же
профиль устойчивости, что и для ламивудина. Неудача лечения связана с мутацией M184V (Van der Horst
2003).
Группа мутаций устойчивости к аналогам тимидина (TAM) включает мутации M41L, D67N, K70R, L210W,
T215Y и K219Q, которые поначалу были описаны при лечении зидовудином (Larder 1989). Сегодня
известно, что они возможны и при лечении ставудином (Loveday1999). По крайней мере три из этих
мутаций приводят к снижению чувствительности к ставудину (Shulman 2001, Calvez 2002, Lafeuillade 2003).
Для перечисленных мутаций был предложен и другой термин — NAM (мутации устойчивости к аналогам
нуклеозидов), поскольку они вызывают перекрестную устойчивость ко всем другим аналогам нуклеозидов,
кроме ламивудина и эмтрицитабина.
Мутантные штаммы, выделенные у пациентов, у которых зидовудин, ламивудин и абакавир не эффективны,
обычно имеют измеримую фенотипическую устойчивость. Две мутации TAM приводят к снижению
чувствительности к зидовудину в 5,5 раза, три мутации TAM — в 29 раз, а четыре мутации TAM и более —
в 100 раз и выше. При снижении чувствительности к абакавиру более чем в 7 раз, этот препарат скорее всего
будет бесполезным. Обычно такая ситуация возникает при трех и более TAM в сочетании с мутацией
M184V (Harrigan 2000).
Фенотипическая устойчивость к ставудину или диданозину возникает реже и обычно выражена слабее
(Larder 2001). Клинический порог устойчивости к ставудину ниже технического порога 1,8. Вероятно, то же
самое относится и к диданозину (Shulman 2004). Поскольку в большинстве систем интерпретации
устойчивости используются биологические пороговые величины, фенотипическая устойчивость может
недооцениваться.
Клинические данные показывают, что тенофовир эффективен даже несмотря на такие мутации NAM как
D67, K70R, T215Y/F и K219Q/E. Однако при трех и более NAM, среди которых есть M41L или L210W,
вирусологический ответ может снижаться (Antinou 2003). Мутации M184V (возникает при лечении
ламивудином) и L74V (возникает при лечении диданозином) могут нивелировать устойчивость, вызванную
ННИОТ-специфичными мутациями L100I и Y181C (Vandamme 1999).
Мутация M184V приводит к восстановлению чувствительности к зидовудину и ставудину, при условии что
имеется не более трех других зидовудин- или ставудин-ассоциированных мутаций (Shafer 1995; Naeger
2001) В исследовании генотипической и фенотипической устойчивости, включавшем 9000 проб, при
сочетании мутаций M41L, L210W и T215Y чувствительность к зидовудину была снижена в 10 раз и более в
79% случаев. Если же им сопутствовала мутация M184V, то десятикратное снижение чувствительности к
зидовудину было только в 52% случаев (Larder 1999a). Мутация M184V также повышает чувствительность к
тенофовиру (Miller 2001). Напротив, сочетание M184V с несколькими NAM или мутациями в положении 65,
74 или 115 снижает чувствительность к диданозину, зальцитабину и абакавиру (Harrigan 2000; Lanier 2001).
Множественная устойчивость (полирезистентность) ко всем НИОТ за исключением ламивудина отмечена
при сочетании мутации T69SSX (это мутация T69S плюс вставка двух аминокислот — SS, SG или SA —
между положениями 69 и 70) с зидовудин-ассоциированной мутацией (или Q151M) и с другой мутацией
множественной устойчивости (V75I, F77L или F116) (Masquelier 2001).
Мутация множественной устойчивости Q151M приводит к умеренному снижению чувствительности к
зидовудину, ставудину, диданозину, зальцитабину и абакавиру (Shafer, 2002a). Она встречается
относительно редко, ее распространенность не достигает 5%. Устойчивости к тенофовиру эта мутация не
вызывает. В то же время, при вставке T69S устойчивость к тенофовиру возрастает почти в 20 раз (Miller
2001).
Вставка T69SSX вместе с мутацией M184V, а также мутация Q151M вместе с M184V приводят к снижению
способности вируса к репликации на 70% (Miller 2003).
Мутация L74V возникает при лечении диданозином или абакавиром и приводит к повышению устойчивости
к диданозину и зальцитабину в 2—5 раз (Winters 1997). Снижение чувствительности к абакавиру в 2—3 раза
на клиническую эффективность этого препарата не влияет, устойчивость к нему появляется при
присоединении других мутаций (Tisdale 1997).
Мутация K65R возникает при лечении тенофовиром, абакавиром, диданозином или зальцитабином и
вызывает умеренную устойчивость к диданозину, абакавиру, зальцитабину, ламивудину, тенофовиру,
эмтрицитабину и, возможно, ставудину (Shafer 2002a, Garcia-Lerma 2003). Перекрестной устойчивости к
зидовудину не возникает (Miller 2004). По сравнению с другими мутациями мутация K65R встречается
очень редко. В крупных клинических испытаниях тенофовира в составе различных схем терапии
(содержащих ИП или ННИОТ), мутация K65R возникла менее чем у 5% пациентов. Однако при лечении
трехкомпонентными схемами из НИОТ (например, тенофовир + ламивудин + абакавир или тенофовир +
ламивудин + диданозин) вирусологическая неудача часто возникала при появлении мутации K65R (Farthing
2003, Gallant 2003, Landman 2003, Jemsek 2004). Главная причина частой неудачи лечения по-видимому
связана с низким генетическим порогом этих схем: появление мутации K65R приводит к утрате
чувствительности ко всем трем препаратам.
При лечении схемами, содержащими зидовудин, частота K65R ниже. K65R и мутации TAM представляют
собой два антагонистических механизма устойчивости. K65R повышает чувствительность к зидовудину и
восстанавливает ее при наличии TAM. И наоборот, TAM снижает устойчивость к тенофовиру, абакавиру,
диданозину и зальцитабину, вызванную мутацией K65R (Parikh 2004).
Как и в случае M184V мутация K65R снижает способность вируса к репликации на 40—50%. При наличии
обеих мутаций — K65R и M184V — способность вируса к репликации снижается на 70% (Miller 2003).
Мутация V75T приводит примерно к пятикратному повышению устойчивости к ставудину, диданозину и
зальцитабину, но встречается редко (Lacey 1994).
В крупных когортных исследованиях измерения чувствительности показали, что почти у 29% пациентов,

стр. 1
(из 4 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>