стр. 1
(из 4 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>

Данный документ переведен и адаптирован Американским
международным союзом здравоохранения (АМСЗ) при
поддержке Агентства США по международному развитию
(АМР США). Настоящий документ входит в Библиотеку
Инфосети «Здоровье Евразии» www.eurasiahealth.org/.

Ресурсы «Здоровья Евразии» предоставляются бесплатно и могут
свободно распространяться. Электронную версию настоящего
документа можно размещать на других сайтах только для
некоммерческих целей, без изменения содержания, с обязательным
указанием Инфосети «Здоровье Евразии» в качестве источника,
уведомлением электронной почтой по адресу library@eurasiahealth.org
и включением ссылки на сайт «Здоровья Евразии»
(www.eurasiahealth.org). Взимать плату за доступ к материалам
«Здоровья Евразии» запрещается.

АМСЗ и «Здоровье Евразии» не отвечают за мнения, изложенные в
данном документе. Ответственность за интерпретацию и
использование этого материала всецело лежит на читателе. АМСЗ и
«Здоровье Евразии» не несут ответственности за какие бы то ни было
ошибки, пропуски и другие возможные проблемы, связанные с данным
документом.

Перевод осуществлён компанией EnRus (http://www.enrus.ru/),
Москва, 2005 г.




Другие материалы по ВИЧ/СПИДу можно найти на сайте
www.eurasiahealth.org/aids/eaknl
Глава 2. Тестирование на ВИЧ
В. Прайзер
Знание о наличии у себя ВИЧ-инфекции дает человеку возможность
воспользоваться самыми современными методами лечения. Поэтому
каждому, кто подвергся риску заражения ВИЧ, рекомендуется пройти
консультирование и тестирование на ВИЧ. В последние годы тестирование на
ВИЧ приобрело громадное клиническое значение, поскольку своевременно
начатая ВААРТ способна не только повысить качество жизни, но и
существенно продлить саму жизнь. В связи с этим в последнее десятилетие
тестированию на ВИЧ стали уделять гораздо больше внимания. Если раньше
в тестировании на ВИЧ усматривали ущемление прав обследуемого, то
сегодня — в эпоху ВААРТ — медицинский работник обязан
доброжелательно советовать пациенту пройти тестирование на ВИЧ, когда
это необходимо, чтобы открыть ему путь к оптимальному лечению ВИЧ-
инфекции. Иногда тестирование на ВИЧ проводится в интересах третьих лиц;
примеры тому — случайная травма иглой, загрязненной кровью пациента с
неизвестным ВИЧ-статусом, и тестирование на ВИЧ беременных.
Если у пациента наблюдается заболевание, которое может быть обусловлено
ВИЧ-инфекцией, тестирование на ВИЧ позволит подтвердить или
опровергнуть подозрения и, таким образом, станет отправной точкой для
дальнейшего диагностического поиска или лечения. Как правило, выясняется,
что пациент болен ВИЧ-инфекцией уже некоторое время (зачастую несколько
лет). Отдельно стоят случаи, в которых есть основания подозревать острую
или приобретенную вертикальным путем ВИЧ-инфекцию. Они требуют
особого подхода к тестированию (см. ниже).
Тестирование на ВИЧ проводится не только при необходимости обследовать
конкретного больного. Оно широко используется для массовых
обследований, в том числе доноров крови, препаратов крови и органов. В
подобных случаях тестирование на ВИЧ позволяет гарантировать
безопасность пациентов, либо используется в целях эпидемиологического
надзора (UNAIDS, 1997a и 2001).


Как проводить тестирование
Обычно основанием для диагноза ВИЧ-инфекции служат косвенные
признаки, а именно специфические антитела к ВИЧ (Gurtler 1996). Они
обнаруживаются фактически у 100% ВИЧ-инфицированных и
свидетельствуют о реакции гуморального иммунитета на вирус. В отличие от
антител ко многим вирусам, антитела к ВИЧ не обеспечивают ни защиту от
ВИЧ, ни иммунитет к ВИЧ-инфекции. Их присутствие лишь означает, что у
пациента на протяжении некоторого времени имеется ВИЧ-инфекция. Случаи
ВИЧ-инфекции, в которых антитела к ВИЧ стойко не определяются,
настолько редки, что пока для клинической практики значения не имеют или
почти не имеют (Connick 2005). Возможно, в будущем эта ситуация
изменится (Kassutto, 2005).
О наличии ВИЧ-инфекции можно судить не только по косвенным, но и по
прямым признакам. К ним относятся: сам ВИЧ (его выделяют в культуре
клеток — только в специализированных лабораториях 3 уровня
биологической безопасности), антигены ВИЧ (в частности, антиген p24,
2 Grundlagen

выявляемый при ИФА) или нуклеиновые кислоты ВИЧ (то есть генетический
материал). Последние выявляют при так называемых тестах на РНК или ДНК
ВИЧ. Именно они используются сегодня чаще всего, поскольку для их
проведения лабораториям не требуется повышенных мер безопасности, они
более чувствительны, чем тесты на антигены ВИЧ, и позволяют получить
количественные данные.
Прямые качественные тесты на ВИЧ (позволяющие получить ответ «да» или
«нет») целесообразно использовать для определения ВИЧ-статуса лишь в
отдельных случаях, таких как подозрение на недавнее заражение ВИЧ и
обследование детей, рожденных ВИЧ-инфицированными женщинами
(подробнее см. ниже). В то же время прямые количественные тесты на
нуклеиновые кислоты ВИЧ имеют гораздо большее значение. В частности,
тест на так называемую вирусную нагрузку, то есть тест, с помощью которого
определяют концентрацию вирусной РНК в крови, стал незаменимым
средством управления антиретровирусной терапией.
Однако следует отметить, что понятие «тест на ВИЧ» (иногда его ошибочно
называют тестом на СПИД), как правило, относят к тестам на антитела к
ВИЧ — косвенные показатели ВИЧ-инфекции.


Диагностика ВИЧ-инфекции с помощью тестов
на антитела к ВИЧ
Чтобы провести тестирование на антитела к ВИЧ, необходимо использовать
по крайней мере два разных теста:
1) предварительный тест (скрининг-тест);

2) подтверждающий тест.
В основе большинства скрининг-тестов лежит ИФА (иммуноферментный
анализ) или сходные методы (UNAIDS, 1997b). Чтобы свести к минимуму
вероятность ложноотрицательного результата, скрининг-тесты должны
обладать высочайшей чувствительностью. Иными словами, они должны
улавливать антитела с низким сродством к антигенам, которые появляются
вскоре после заражения. Кроме того, скрининг-тесты должны определять
антитела к ВИЧ разных типов (ВИЧ-1, ВИЧ-2) и групп (ВИЧ-1-N, ВИЧ-1-O,
ВИЧ-1-M) (UNAIDS/WHO, 1992 и 1997).
Положительный результат скрининг-теста необходимо подтвердить по
крайней мере одним подтверждающим тестом. В ряде стран, например, в
Германии и США, в качестве подтверждающего теста используют так
называемый иммуноблоттинг или метод иммунофлюоресценции. В других
странах (например, в Великобритании) положительный результат скрининг-
теста подтверждают разными исследованиями в определенной
последовательности по установленному алгоритму. Последний подход ничем
не хуже первого и даже имеет ряд преимуществ, среди которых более низкая
стоимость и большая объективность (Tamashiro 1993).
Error! Style not defined. 3


Скрининг-тест по методу ИФА
Многие тест-системы для ИФА выпускаются в виде 96-луночных планшетов
для микротитрования. Хотя практически все этапы исследования можно
выполнить вручную, планшеты позволяют полностью автоматизировать
процесс, благодаря чему тестирование многих проб крови становится и
безопасным, и экономичным. По сходному принципу сделаны и многие
другие тест-системы, которые помещаются в специальные лабораторные
приборы, в которых титрование и анализ полностью автоматизированы.
Можно выделить несколько вариантов ИФА. Все они основаны на
специфической реакции «антиген—антитело». В самых первых (тестах
первого поколения) использовался антиген «цельного вируса», который
получали в культуре клеток. В современных тестах (тестах второго и
последующих поколений) используется смесь рекомбинантных вирусных
протеинов или синтетических пептидов, представляющих собой наиболее
иммуногенные детерминанты ВИЧ.
Чтобы ИФА выявила имеющийся в крови пациента вирус, используемые в
тесте антигены должны соответствовать тем антителам, что могли
выработаться в организме пациента к ВИЧ определенного типа (ВИЧ-1, ВИЧ-
2) или группы (ВИЧ-1-N, ВИЧ-1-O, ВИЧ-1-M). Так, неверно использовать
ИФА на антитела только к ВИЧ-1, чтобы обследовать пациентов,
заразившихся ВИЧ-2 в Западной Африке. В то же время, в силу более или
менее выраженной способности к перекрестным реакциям, достоверно
различить случаи ВИЧ-1- и ВИЧ-2-инфекции способны лишь специальные
исследования, о которых иногда необходимо договариваться непосредственно
с лабораторией.
В большинстве тест-систем для ИФА вирусный антиген нанесен на так
называемую твердую фазу (например, на дно ячейки планшета). В ячейку
добавляют сыворотку пациента. Если в ней содержатся специфические
антитела к этим антигенам, происходит реакция антиген—антитело.
Следующий этап исследования — отмывание. Его задача состоит в том,
чтобы удалить все несвязавшиеся с антигеном компоненты сыворотки, в том
числе и антитела, которые не смогли распознать вирусные антигены.
Связавшиеся с вирусными антигенами антитела выявляют на следующем
этапе исследования — при добавлении меченного ферментом конъюгата. В
качестве конъюгата выступают связанные с молекулой фермента либо другие
антитела, например, козьи антитела к человеческим иммуноглобулинам
(антиглобулиновый тест), либо вирусные антигены, причем зачастую те же,
что нанесены на твердую фазу (иммунометрический тест или сэндвич-тест —
тесты третьего поколения). Преимущество иммунометрических тестов
состоит в том, что они выявляют антитела всех классов (в том числе и ранние
IgM-антитела, не играющие существенной роли в развитии ВИЧ-инфекции).
Оставшийся несвязанным конъюгат вновь отмывают.
На последнем этапе исследования добавляют субстрат. Если конъюгат
связался с комплексом антиген—антитело, соединенный с ним фермент
воздействует на субстрат, меняя его цвет. Эта реакция сопровождается
выделением света, интенсивность которого (оптическая плотность)
измеряется. Полученный показатель пропорционален активности антител в
4 Grundlagen

образце крови. В каждой тест-системе имеются образы для положительного и
отрицательного контроля; оптическую плотность, полученную при их
обработке, часто используют в качестве пороговой (то есть такой оптической
плотности, которая служит эталоном для определения результатов теста как
положительных или отрицательных).
Особый вид тестов — конкурентные. Во время таких тестов вместе с
образцом крови пациента к твердой фазе добавляют меченные ферментом
антитела к ВИЧ. Эти антитела конкурируют с антителами, присутствующими
в крови пациента, за антигены. Если в исследуемом образце антитела к ВИЧ
отсутствуют, все или почти все меченные ферментом антитела связываются с
антигенами, и добавленный субстрат интенсивно окрашивается. И наоборот:
чем больше в образце крови пациента содержится специфических антител,
тем слабее окрашивается субстрат. Конкурентные методы исследования, как
правило, высокоспецифичны.
Каждый метод исследования обладает собственными преимуществами и
недостатками. Следовательно, всегда важно знать, каким именно методом
проведено тестирование. Так называемые тесты четвертого поколения
выявляют и антитела к ВИЧ, и антиген p24, что позволяет сократить так
называемый период диагностического окна (см. ниже) (Brust 2000).
Достоверность результатов теста определяется двумя факторами:
чувствительностью и специфичностью. Чувствительность означает
способность теста давать положительный результат при наличии болезни (в
данном случае, при наличии антител к ВИЧ в сыворотке). В свою очередь,
под специфичностью понимают способность теста давать отрицательный
результат в отсутствие болезни (в данном случае, при отсутствии антител к
ВИЧ в сыворотке).
Скрининг-тесты тесты обладают высочайшей чувствительностью (почти
100%), то есть они способны определить малейшую концентрацию антител к
ВИЧ, наблюдаемую в самом начале ВИЧ-инфекции. Высокой
чувствительностью обеспечивается низкая вероятность ложноотрицательного
результата. Иными словами, если пациент инфицирован ВИЧ, то
высокочувствительный тест не позволит ошибочно заключить, что ВИЧ-
инфекция у него отсутствует. Если для скрининг-теста выбран тест с высокой
чувствительностью, то его отрицательный результат через 6 и более месяцев
после чреватого заражением контакта позволит с уверенностью сказать, что
вероятность инфекции у данного пациента практически равна нулю (Preiser
2000).
Тесты на ВИЧ, которые поступили в продажу после 7 декабря 2003 г.,
должны отвечать требованиям нового закона Европейского Союза в
отношении средств лабораторной диагностики и иметь маркировку CE. В
частности, к ним предъявляется такое требование: тест должен дать
положительный результат при исследовании 600 ВИЧ-положительных
образцов, включая 200 ВИЧ-2-положительных, полученных на разных
стадиях ВИЧ-инфекции.
Таким образом, главное качество скрининг-теста на ВИЧ — максимально
возможная чувствительность. Он не имеет права дать отрицательный
результат при исследовании ВИЧ-положительного образца, поскольку это
Error! Style not defined. 5

чревато серьезными последствиями. В то же время, при столь высокой
чувствительности специфичность отчасти снижается. На деле это означает,
что положительный результат теста может оказаться ложноположительным.
То есть тест может показать присутствие антител к ВИЧ в образце, в котором
их нет. Это бывает, когда положительную реакцию дает нечто другое,
ошибочно принятое за антитела к ВИЧ. Ложноположительные результаты
обусловлены активацией иммунной системы по тем или иным причинам
(острая вирусная инфекция, беременность, иммунизация или аутоиммунное
заболевание). Специфичность современных скрининг-тестов на ВИЧ
составляет не менее 99,5%, то есть при исследовании 4 000 ВИЧ-
отрицательных образцов они дают не больше 20 ложноположительных
результатов.
Поскольку любой тест может дать неспецифическую ложноположительную
реакцию, положительный результат скрининг-теста предпочтительно
называть «реактивным «. Это нужно, чтобы ложноположительный результат
не воспринимался как окончательное лабораторное заключение и все
реактивные результаты обязательно проверялись подтверждающими тестами.
«Положительным» можно называть только подтвержденный реактивный
результат тестирования на ВИЧ!
Внимание! Реактивный результат скрининг-теста не означает, что пациент
ВИЧ-инфицирован! Только положительный результат подтверждающего
теста является основанием для диагноза ВИЧ-инфекции и, теоретически,
только его следует сообщать пациенту!
Среди причин ложноположительных (и ложноотрицательных) результатов
тестов на ВИЧ — ошибки, допущенные либо в лаборатории, либо до
отправки образцов в лабораторию, либо после получения результатов.
Случается, что образцы путают или материал из одного образца попадает в
другой из-за погрешностей в ходе исследования, но возможны и чисто
канцелярские ошибки (при маркировке пробирок, заполнении направлений в
лабораторию, вводе данных в базу лаборатории или клиники). Следовательно,
обеспечение качества лабораторных исследований требует пристального
внимания даже к таким, казалось бы несущественным, деталям!

Подтверждающий иммуноблоттинг
Иммуноблоттинг — наиболее часто используемый метод подтверждения
реактивных результатов скрининг-тестов. Чтобы получить тест-полоски для
иммуноблоттинга, ВИЧ поселяют в культуру клеток, инкубируют, очищают и
денатурируют (расщепляют на части). Затем с помощью электрофореза
вирусные протеины-антигены разделяют в соответствии с их молекулярным
весом и наносят на нитроцеллюлозную мембрану, которую разрезают на
ленты. Чтобы провести тест, сыворотку пациента инкубируют с мембраной.

стр. 1
(из 4 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>