<< Предыдущая

стр. 2
(из 5 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>



2. Цикл репликации ВИЧ
2.1. Проникновение в клетку
CD4 — главный рецептор ВИЧ
CD4 — это мономерный гликопротеид массой 58 кДа, который обнаружива-
ется на поверхности примерно 60% T-лимфоцитов, предшественников T-
лимфоцитов в костном мозге и тимусе, а также моноцитов, макрофагов, эози-
нофилов, дендритных клеток и клеток микроглии ЦНС. Внеклеточный уча-
сток CD4 на T-лимфоцитах состоит из 370 аминокислот, гидрофобный транс-
мембранный и внутриклеточный участки — из 25 и 38 аминокислот соответ-
ственно. Внеклеточный участок содержит четыре иммуноглобулиноподобных
домена D1—D4 и область V2 (аминокислоты 40—55), играющую важную
роль в присоединении gp120 к CD4. Эта область перекрывается с участком
связывания молекул HLA класса II, которые являются естественными лиган-
дами CD4.
Идентификация на лимфоцитах CD4 участка связывания gp120 подтолкнула к
попыткам использования свободных молекул CD4 (sCD4) с целью нейтрали-
зации циркулирующего вируса и предупреждения заражения новых клеток.
Однако эти попытки провалились: хотя лабораторные штаммы легко нейтра-
лизовались sCD4, нейтрализации штаммов, полученных от больных, добиться
не удалось. Более того, оказалось, что sCD4 способны вызывать конформаци-
онные изменения внешней оболочки вируса, которые облегчали заражение
клеток-мишеней [19].
Молекулы CD4 связываются с антигенраспознающими рецепторами T-
лимфоцитов и молекулами HLA класса II на поверхности антигенпредстав-
ляющих клеток. Связывание gp120 с CD4 не только служит ключевым момен-
том в проникновении вируса в клетку, но и нарушает внутриклеточную пере-
дачу сигнала и вызывает апопотоз лимфоцитов CD4 [20]. В последние два го-
да возобновился интерес к идее блокирования CD4 как основного клеточного
рецептора ВИЧ. PRO542 представляет собой полученный генно-
инженерными методами тетравалентный белок слияния CD4-IgG2, который
не только подавлял репликацию in vitro, но и показал впечатляющую проти-
вовирусную активность у больных с высокой вирусной нагрузкой в первых
клинических испытаниях [21].
О том, что молекула CD4 является главным и необходимым рецептором для
ВИЧ-1, ВИЧ-2 и вируса иммунодефицита обезьян, было известно уже в
1984 г. [22, 23]. Однако позже с помощью трансфекции человеческих CD4 в
клеточные линии животных было показано, что одних только молекул CD4 на
поверхности клеток для проникновения ВИЧ недостаточно. Был сделан вывод
о существовании дополнительных рецепторов — корецепторов. Оказалось
также, что некоторые лабораторные штаммы ВИЧ-1, а также штаммы ВИЧ-2
и вируса иммунодефицита обезьян могут проникать в клетки, лишенные мо-
лекул CD4. Примечательно, что моноклональные антитела к CD4 индуцируют
связывание конформационных эпитопов (CD4I) с gp120 этих CD4-
независимых штаммов. Это позволило предположить, что gp120 CD4-
4-8 Патогенез ВИЧ1-инфекции




независимых штаммов уже несут области, необходимые для распознавания
корецепторов, поэтому связывание с CD4 не обязательно для проникновения
этих штаммов в клетку. CD4-независимые штаммы легко нейтрализуются сы-
вороткой ВИЧ-инфицированных, следовательно они являются мишенью им-
мунного ответа [22].
Рецепторы хемокинов — корецепторы ВИЧ
Важной вехой в изучении начальной стадии проникновения ВИЧ-1 в клетку
стало открытие, сделанное в 1995 г. Cocchi и коллегами: в совместных куль-
турах лимфоциты CD8, полученные от ВИЧ-инфицированных, способны по-
давлять репродукцию ВИЧ в аутологичных и аллогенных лимфоцитах CD4,
причем этот эффект не связан с цитотоксичностью [25]. В супернатанатах
лимфоцитов CD8, взятых у ВИЧ-инфицированных, были обнаружены хемо-
кины MIP-1?, MIP-1? и RANTES. Было показано, что эти хемокины могут до-
зозависимо подавлять репродукцию некоторых штаммов вируса [26]. MIP-1?,
MIP-1? и RANTES — это естественные лиганды рецептора хемокинов CCR5.
Спустя несколько месяцев после сообщения Cocchi несколькими исследова-
телями было показано, что CCR5 служит необходимым корецептором для мо-
ноцитотропных (M-тропных) штаммов ВИЧ-1 [27, 28, 29]. За несколько не-
дель до этого было выяснено, что корецептором для T-лимфоцитотропных (T-
тропных) штаммов ВИЧ служит рецептор хемокинов CXCR4 (фузин) [28].
Моноцитотропные (M-тропные) штаммы ВИЧ-1 — это штаммы, которые хо-
рошо размножаются в культурах макрофагов, но не способны заражать T-
клеточные линии (т.е. перевиваемые культуры T-лимфоцитов), однако легко
инфицируют первичные культуры T-лимфоцитов крови. T-тропные штаммы,
наоборот, хорошо культивируются в T-клеточных линиях и плохо — в мак-
рофагах, и легко инфицируют первичные культуры T-лимфоцитов крови. Та-
ким образом, следует отметить, что M-тропные и T-тропные штаммы ВИЧ-1
легко заражают первичные культуры T-лимфоцитов человека.
Хемокины (хемотаксические цитокины) и их рецепторы изначально были
описаны как факторы, усиливающие миграцию лейкоцитов (хемотаксис) и их
провоспалительную активность. Хемокины представляют собой белки,
имеющие в составе 68—120 аминокислот. В зависимости от порядка цистеи-
новых последовательностей хемокины делят на C-X-C (?-хемокины), C-C (?-
хемокины) и C-хемокины. Хемокины гомологичны между собой по структуре
и могут связываться с одними и теми же рецепторами. Хемокины действуют
через рецепторы, имеющие семь трансмембранных доменов и сопряженные с
G-белками.
Естественный лиганд рецептора хемокинов CXCR4 — фактор SDF-1 (от англ.
«stromal cell-derived factor» — выделенный из стромальных клеток). Этот фак-
тор предотвращает заражение активированных лимфоцитов CD4 T-тропными
штаммами ВИЧ. Хемокины RANTES (от англ. Regulation-upon-Activation,
Normal T Expressed and Secreted — молекулы «регуляции при активации»,
экспрессируемые и секретируемые нормальными T-лимфоцитами) и макрофа-
гальные воспалительные белки MIP-1? и MIP-1? (от англ. macrophage
inhibitory protein) являются естественными лигандами рецептора CCR5 и спо-
2. Цикл репликации ВИЧ 4-9




собны предотвращать инфицирование T-лимфоцитов M-тропными штаммами
ВИЧ. Роль корецепторов показана на рис. 4: T-тропные штаммы ВИЧ зара-
жают преимущественно активированные лимфоциты CD4 крови и клеточные
линии, используя для входа в клетку рецепторы CXCR4 и CD4. M-тропные
штаммы способны заражать лимфоциты CD4, моноциты и макрофаги и ис-
пользуют для входа в клетку рецепторы CCR5 и CD4.
Взаимодействие gp120 и клеточных рецепторов сегодня стали более понятны.
Гликопротеид gp120 сначала связывается с определенными эпитопами CD4.
После этого gp120 претерпевает конформационные изменения, обеспечиваю-
щие более эффективное взаимодействие его петли V3 с соответствующим ко-
рецептором. От связывания gp120 с корецептором зависит слияние внешней
оболочки вируса с клеточной мембраной. Трансмембранный гликопротеид
gp41 (часть гликопротеида внешней оболочки вируса gp160) играет ключевую
роль в слиянии внешней оболочки вируса и клеточной мембраны подобно ге-
магглютинину вируса гриппа. После связывания gp120 с рецептором CD4, в
gp41 происходят конформационные изменения, в результате которых гидро-
фобный N-концевой фрагмент gp41 внедряется в мембрану клетки-мишени.
Предположение о том, что gp41 действует наподобие пружинной защелки,
было подтверждено с помощью кристаллографического анализа [31]. После
того, как были расшифрованы ключевые для этого процесса аминокислотные
последовательности, усилия были направлены на синтез пептидов, способных
связываться с доменами gp41, необходимыми для индукции конформацион-
ных изменений. Такое связывание должно предотвращать слияние внешней
оболочки вируса с клеточной мембраной.
Первым из пептидов, связывающих gp41 и включенных в клинические испы-
тания для оценки подавления репродукции вируса, был T-20 (энфувиртид)
[32]. В настоящее время энфувиртид уже используется для лечения некоторых
групп больных. Его недостаток — невозможность приема внутрь: препарат
вводится в инъекциях.
С помощью трансфекции клеточных линий были открыты и другие рецепто-
ры хемокинов, которые наряду с CCR5 и CXCR4 служат корецепторами для
некоторых штаммов ВИЧ — CCR3, CCR2, CCR8, CCR9, STRL33 («Bonzo»),
Gpr 15 («Bob»), Gpr 1, APJ и ChemR23 [33, 34]. По некоторым данным, APJ
служит корецептором ВИЧ для проникновения в клетки ЦНС. Несмотря на
широкий спектр корецепторов ВИЧ-1, in vivo основное значение, по-
видимому, играют CCR5 и CXCR4.
Важность CCR5 как ведущего корецептора M-тропных штаммов ВИЧ стано-
вится видна из следующего наблюдения: большинство людей с дефектным
геном CCR5 не восприимчивы к ВИЧ-1 [35]. Эксперименты показали, что
лимфоциты этих людей in vitro устойчивы к M-тропным штаммам ВИЧ-1, но
заражаются T-тропными штаммами. Лимфоциты этих людей не экспрессиру-
ют на своей поверхности рецептор CCR5 вследствие делеции 32 пар нуклео-
тидов в гене CCR5. Во всем мире известно лишь несколько случаев ВИЧ-
инфекции у гомозигот по делеции гена CCR5. Не удивительно, что все они
были вызваны T-тропными штаммами, корецептором которым служит
CXCR4 [36].
4-10 Патогенез ВИЧ1-инфекции




Рисунок 4. Предотвращение проникновения в клетку М-тропных и Т-тропных штаммов
ВИЧ путем связывания естественными лигандами рецепторов хемокинов CCR5 и
CXСR4.



Эпидемиологические исследования показали, что по делеции гена CCR5 гете-
розиготны 10—20% белых (доля гетерозигот выше у выходцев из северной
Европы), а гомозиготны — около 1% белых [37]. У чернокожих и азиатов та-
кой делеции гена CCR5 не обнаружено; это говорит о том, что мутация воз-
никла уже после разделения человечества на расы в процессе эволюции.
У гетерозигот по делеции 32 пар нуклеотидов в гене CCR5 снижена экспрес-
сия рецептора CCR5 на поверхности клеток; показано, что среди них больше
лиц с длительным непрогрессирующим течением ВИЧ-инфекции [37]. Кроме
того, у ВИЧ-инфицированных гетерозигот по делеции 32 пар нуклеотидов в
гене CCR5 медленнее прогрессирует СПИД, лучше ответ на ВААРТ и меньше
частота лимфом. Это говорит о том, что плотность рецепторов CCR5 на по-
верхности клетки влияет на репликацию ВИЧ не только in vitro, но и in vivo.
Помимо делеции 32 оснований гена CCR5 были описаны и другие случаи ге-
нетического полиморфизма в отношении рецепторов хемокинов (CCR2) и их
промоторов (CCR5), которые влияли на скорость прогрессирования ВИЧ-
инфекции [38, 39].
У больных с быстрым прогрессированием инфекции (быстрое падение числа
лимфоцитов CD4) штаммы, использующие в качестве основного корецептора
CXCR4, выделяются чаще, чем у больных со стабильным числом лимфоцитов
CD4.
Экспрессия корецепторов на лимфоцитах CD4 зависит от уровня активности
этих клеток.
2. Цикл репликации ВИЧ 4-11




Рецептор CXCR4 экспрессируется главным образом на девственных T-
лимфоцитах, а рецептор CCR5 — на активированных T-лимфоцитах, клетках
памяти и эффекторных лимфоцитах. В ранней стадии ВИЧ1-инфекции обна-
руживаются преимущественно M-тропные штаммы ВИЧ. Примечательно, что
M-тропные штаммы ВИЧ передаются чаще независимо от того, какие штам-
мы — T-тропные или нет — преобладают у источника инфекции. Пока неяс-
но, обусловлено ли это избирательным транспортом M-тропных штаммов
дендритными клетками подслизистого слоя или благоприятствованием мест-
ной хемокиновой и цитокиновой среды для репродукции M-тропных вирусов.
Привлекают внимание последние исследования Cheng-Meyer и соавт., выдви-
нувших гипотезу о том, что благодаря репродукции в макрофагах M-тропным
вирусам легче ускользнуть от иммунной системы, чем T-тропным, что и дает
им преимущество в выживании.
В связи с этим блокада рецепторов CCR5 представляется перспективным на-
правлением терапии ВИЧ-инфекции. Моноклональные антитела к CCR5 (2D7
и другие) in vitro способны блокировать проникновение штаммов, исполь-
зующих в качестве корецепторов CCR5, в лимфоциты CD4 и макрофаги. Раз-
работаны и уже проходят клинические испытания низкомолекулярные блока-
торы рецепторов CCR5. Однако исследования in vitro, а также эксперименты
на мышах линии SCID, показали, что подавление штаммов, использующих
корецепторы CCR5, может приводить к изменению их тропности в сторону
корецепторов CXCR4.
Низкомолекулярные блокаторы, в том числе T-22, ALX40-4C и AMD3100,
могут блокировать рецепторы CXCR4 [40, 41] и в настоящее время проходят
доклинические и клинические испытания.
Сегодня разрабатываются методы модулирования экспрессии хемокиновых
рецепторов. Интракины — это хемокины, которые находятся в цитоплазме и
могут захватывать и связывать соответствующие рецепторы у поверхности
клетки [42]. «Короткие интерферирующие РНК» (киРНК) являются новым
молекулярным инструментом селективной инактивации генов-мишеней.
Двухцепочечная РНК расщепляется ферментом dicer-1 на короткие части
(“21-23-меры”). Эти олигомеры могут комплементарно связываться с длин-
ными последовательностями РНК, после чего последние распадаются. Такие
олигомеры сегодня обнаружены у растений с противовирусной активностью.
Использование киРНК против CCR5 может предотвратить экспрессию CCR5
in vitro.
Хотя использование блокаторов хемокиновых рецепторов кажется перспек-
тивным направлением в лечении ВИЧ-инфекции, немало вопросов еще оста-
ются открытыми. Эксперименты на мышах с инактивированными генами
CXCR4 или SDF-1 обнаружили тяжелые нарушения кроветворения и развития
мозжечка [43]. Не вызовет ли блокада рецепторов CXCR4 у детей или взрос-
лых нарушений со стороны каких-либо систем органов, пока не известно.

2.2. События после проникновения вируса в клетку
После слияния вируса с мембраной клетки вирусной ядро высвобождается в
цитоплазму. Эти «ранние события» сегодня подробно изучаются. ВИЧ спосо-
4-12 Патогенез ВИЧ1-инфекции




бен проникать в лимфоциты макак-резус, но до начала обратной транскрип-
ции или вскоре после него репликация вируса прекращается. Эта внутрикле-
точная блокада опосредована клеточным фактором TRIM5?, который являет-
ся компонентом клеточных органелл. У разных видов животных
TRIM5? специфически подавляет определенные ретровирусы. Например
TRIM5? макак-резус (TRIM5? rh) сильнее подавляет репликацию ВИЧ, чем
TRIM5? человека, в то время как вирус иммунодефицита обезьян, который в
естественных условиях патогенен для макак, менее чувствителен к другим
формам TRIM5?. Отчасти это объясняет видовую специфичность ВИЧ к
клеткам человека (44). TRIM5? клеток человека и других приматов может
подавлять репликацию других лентивирусов и является новым фактором кле-
точной устойчивости, биологическое значение которого до конца не ясно. В
точности не известно также, как TRIM5? блокирует обратную транскрипцию;
предполагается, что TRIM5? воздействует на капсидный белок проникающе-
го в клетку вируса, вызывая его полную протеолитическую деградацию.
ВИЧ проникает как в активированные T-лимфоциты, так и в покоящиеся, од-
нако в покоящихся клетках не завершается синтез вирусной ДНК [45]. Синтез
провирусной ДНК на матрице вирусной РНК в цитоплазме клетки под дейст-
вием фермента обратной транскриптазы — это ключевой момент в репродук-
ции ВИЧ. Блокирование обратной транскриптазы нуклеозидным ингибитором
зидовудином было первой попыткой подавить репродукцию вируса у ВИЧ-
инфицированных. Начиная с середины 80-х годов арсенал ингибиторов об-
ратной транскриптазы значительно расширился, и сегодня в клинической
практике применяются различные нуклеозидные, нуклеотидные и ненуклео-
зидные ингибиторы обратной транскриптазы.
Обратная транскрипция происходит в несколько этапов. После связывания
праймеров тРНК в участке PBS (участок связывания праймера) начинается
синтез минус-цепи провирусной ДНК, который завершается на 5'-концевом
участке с образованием короткой цепи ДНК R/U5. Следующий этап — рас-
щепление РНК над участком PBS вирусным ферментом РНКазой H и сдвиг
рамки ДНК R/U5 с гибридизацией в области R-участка на 3'-концевом участке
РНК. После этого завершаются синтез полноразмерной провирусной ДНК и
расщепление тРНК. В результате обратной транскрипции образуется двойная
цепь ДНК ВИЧ с длинными концевыми повторами LTR на каждом конце.

<< Предыдущая

стр. 2
(из 5 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>