<< Предыдущая

стр. 5
(из 7 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>

Возросшая угроза биотерроризма делает необходимостью объединение сил всего мирового сообщества для борьбы с этой опасностью.
ВОЗ рекомендует разработать планы международной кооперации и сотрудничества по этой проблеме, максимально усиливая инфраструктуру здравоохранения, санитарный надзор и готовность к ликвидации вспышек.
ВОЗ подготовлена специализированная программа по созданию системы глобального мониторинга, исследований и подготовки персонала для контроля инфекционных болезней, которая также учитывает возможное террористическое применение инфекционных агентов.
Идеология этой программы – создание региональных центров, интегрированных с федеральными и региональными службами эпидемиологического надзора, сетью поликлиник и больниц, диагностических лабораторий, НИИ и учебных заведений, а также с предприятиями фарминдустрии с тем, чтобы сформировать региональные программы по обеспечению самодостаточности регионов в выявлении и ликвидации природных или террористических вспышек инфекционных заболеваний. Такие центры должны иметь полноценную поддержку ВОЗ, национальных органов здравоохранения и иметь статус региональных отделений ВОЗ.
В настоящее время в мире уже имеются огромные ресурсы для борьбы с инфекционными болезнями, которые будут использованы для противодействия биотерроризму.
Они включают сотни Сотрудничающих центров ВОЗ по всему миру, специализированных на отдельных инфекциях, сеть лабораторий ПанАмериканской организации здравоохранения (PAHO), Международную сеть клинической эпидемиологии (INCLEN), сеть институтов Пастера, сеть исследовательских центров Национального института здравоохранения (NIH) (в которую вовлечены многие университеты США), Центры по контролю за заболеваемостью (CDC) во многих странах, многие из которых выполняют подготовку полевых эпидемиологов в разных регионах. Армия и ВМФ США также развернули специализированные исследовательские центры в ряде стран. Следует отметить, что этот ресурс весьма специализирован на конкретных задачах и, за исключением центров Службы эпидемиологической разведки (EIS), не ориентирован на обнаружение и идентификацию всего спектра патогенов. [8]
Другой подход был предложен выдающимся эпидемиологом D.A. Henderson, который на основе своего многолетнего опыта организатора и непосредственного участника программы глобальной ликвидации заболевания оспой пришел к выводу о необходимости создания системы стационарных международных центров, размещенных в 15 регионах, и которые должны включать в свою структуру:
клинические и амбулаторные службы по инфекционным болезням;
исследовательские диагностические лаборатории;
эпидотряды с функцией служб эпидемиологической разведки (EIS), обеспечивающие контроль популяции региона с численностью 2-5 млн. человек;
образовательно-тренировочную базу для подготовки национального и международного персонала.
Систематические наблюдения за конкретным регионом позволят получать бесценные базы данных, изучать влияние различных факторов на эпидемиологическую ситуацию и выявлять необычные случаи или «подозрительные» случаи, требующие более глубокого изучения.
По мнению D.Henderson, сеть региональных центров должна включать взаимодействие с такими организациями, как CDC, NIAID и академическими научными центрами. Для обеспечения стабильной работы и легитимности необходима их тесная связь с ВОЗ и государственными структурами стран, в которых они находятся.
Международные структуры, описанные выше, обеспечивают не только эпидемическое благополучие региона в случае природных или террористических инцидентов с микроорганизмами, но и способствуют решению чрезвычайно сложной политической задачи – созданию атмосферы доверия, что является важнейшим фактором укрепления Конвенции 1972 г. по биологическому и токсинному оружию. [8]
После происшедшего 11 сентября и США, и ведущие европейские государства ввели дополнительные меры для защиты населения от биологического оружия. Но, по мнению экспертов, ни одна страна самостоятельно не сможет справиться со сколько-нибудь серьезной эпидемией.
Одной из программ совместных действий по борьбе с биотерроризмом является программа разработанная Европейским Союзом (ЕС).
Министры здравоохранения стран ЕС приняли решение реализовать обширную программу мер по борьбе с биотерроризмом. Она предусматривает создание в рамках Евросоюза общей специальной службы, призванной оказывать помощь одной или нескольким странам ЕС, подвергающимся опасности биотерроризма. В ее рамках будут действовать группы медиков и фармацевтов, призванных изучать потенциальные угрозы и разрабатывать меры противодействия, координировать разработку и выпуск необходимых вакцин и препаратов в фармацевтической промышленности. Одновременно главы ведомств Еврокомиссии, курирующие промышленность и здравоохранение, согласовали план исследовательских мер по выявлению и классификации возбудителей наиболее опасных болезней и, соответственно, программу обеспечения лечебных учреждений эффективными препаратами, включая разработку новых вакцин и прививок. С этой целью Еврокомиссия рекомендовала фармацевтической промышленности создать резервные мощности по выпуску данных препаратов и провести изыскания по разработке новых средств защиты населения. Для проведения этих работ фармацевтические предприятия получат субсидии от Еврокомиссии.[40]
В Канаде на встрече министров здравоохранения США, Канады, Японии, Великобритании, Франции, Германии, Италии и Мексики было подписано соглашение об объединении исследований, обмене информацией и общих планах в области защиты от биологического оружия. Кроме того, было принято решение об объединении запасов вакцин и антибиотиков, имеющихся в медицинских учреждениях этих стран. В случае эпидемии какой-либо инфекции в одной стране ее партнеры обязуются безвозмездно предоставить ей вакцину и медицинские препараты. Координацией работы антитеррористической группы займутся канадцы.[41]
НАТО также приступил к действиям по рассмотрению гипотетических угроз биотерроризма и способов реагирования на них. Эта проблема впервые была затронута во время совместного заседания Северо-Атлантического Совета (представители 19 стран-союзников при НАТО) и Политическим Комитетом по Безопасности ЕС. Собравшиеся рассмотрели возможность создания рабочей группы НАТО-ЕС для совместного реагирования на угрозу биотерроризма. Проблема заключается в том, что Атлантический Альянс не имеет средств реагирования на гражданские чрезвычайные ситуации и пытается скоординировать некоторые свои действия с Европейским Сообществом. Если работы будут продолжаться в направлении, выбранном НАТО, то можно с уверенностью сказать, что именно Альянс будет просить помощи у ЕС, в то время, как сейчас, Сообществу необходимы средства союзников для приведения в действие Сил Быстрого Реагирования Сообщества. Лидеры ЕС, собравшиеся в Генте (Бельгия), особый упор сделали на необходимость осуществления скоординированного плана по защите от биотерроризма. План включает в себя взаимодействие всех европейских служб Гражданской Защиты, избрание авторитетного лидера в этой области, контроль за экспортом любого «подозрительного» продукта и сотрудничество всех стран-членов Европейского Сообщества при изготовлении запасов вакцин.[42]
Принимая во внимание растущие опасения использования террористами биологических агентов, и оценку уязвимости общества можно заключить, что вероятность акта с использованием биологического оружия существует и, в случае успешного применения, последствия его могут быть катастрофическими. Есть различные варианты ответа на такую угрозу, но, очевидно, что необходимым и главным условием успешного предотвращения и устранения последствий таких инцидентов, является объединение сил всего мирового сообщества, путем участия в совместных программах, создания сети взаимодействующих международных структур, разработки международных законов и правил.



Список литературы к разделу 2.

Perl R.F. Terrorism, the Future, and U.S. Foreign Policy. 2001.CRS Issue Brief.
Даниленко Н.Н О проблеме терроризма в Российской Федерации http://www.waaf.ru/1o.html
Леб В., Вард Д. Возможности террористов по ведению химической и биологической войны. США , International Herald Tribune, http://nuclearno.ru/text.asp?580
Tucker JB. Historical trends related to bioterrorism: An empirical analysis. Emerg Infect Dis. 1999,v.5, N4 p.498-504.
Regis Ed. Evaluating the Threat. Does Mass Biopanic Portend Mass Destruction? Sci. American, Dec., 2001 http://www.sciam.com/2001/1201issue/1201scicit2.html
Danzig R, Berkowsky P.B. Why should we be concerned about biological warfare? JAMA. 1997 v.278,N5, p.431-432.
Биотерроризм: статистика и философия. Экология и Жизнь. 2001. http://www.ecolife.ru/news/info20-11-01.shtml
Сандахчиев Л.С., Нетесов, С.В. Мартынюк Р.А.. Международные центры как основа в борьбе с инфекционными болезнями и противодействии биотерроризму. Российско-американский симпозиум «Терроризм в высокотехнологичном обществе – современные методы предотвращения и борьбы с его проявлениями» (Москва, 4-6 июня 2001 г.)
Henderson D.A. The Looming Threat of Bioterrorism. Science. 1999.V 283, N 5406, p.1279-1282. http://cas.bellarmine.edu/tietjen/Ecology/looming_threat_of_bioterrorism.htm
Новости медицины. Психологи и военные из США обратились за помощью к специалистам-психологам из России. 2001, Сайт MedLinks http://www.medlinks.ru/article.php?sid=1171
Moodie M. et al., BIOLOGICAL TERRORISM IN THE UNITED STATES:THREAT, PREPAREDNESS, AND RESPONSE FULL REPORT. Submitted by the Chemical and Biological Arms Control Institute (CBACI) November 2000. http://www.cbaci.org/
Rotz L. D. et al., Public Health Assessment of Potential Biological Terrorism Agents. Emerging Infectious Diseases. 2002, v. 8, N2, p. 225-231. http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol8no2/01-0164.htm
Biological and chemical terrorism: strategic plan for preparedness and response. Recommendations of the CDC Strategic Planning Workgroup. MMWR Recomm Rep. 2000 v. N 49, p.1-14.
Sanders R. US Bioterrorism: White Power, White Powder & White House. 2001
Web site COAT. http://www.ncf.ca/coat/
Cashman, S, Baldor R. MD Conference Report Bioterrorism and War: Ensuring Public Health American Public Health Association (APHA) 129th Annual Meeting -- October 21-25, 2001, Atlanta, Georgia. Medscape Family Medicine 1(2), 2001
Rosenthal S.R., Merchlinsky M., Kleppinger C., and Goldenthal K.L. Developing New Smallpox Vaccines. Emerg Infect Dis. 2001 Nov-Dec;7(6):920-926.
Technical Advisory Group on Human Monkeypox. Report of a WHO meeting. Geneva, Switzerland, 11-12 January 1999.WHO/CDS/CSR/APH/99.5
http://www.who.int/emc-documents/viral_diseases/whocdscsraph995c.html
Henderson D.A. Bioterrorism as a Public Health Threat. Emerg Infect Dis. 1998 Vol. 4, No. 3, p.488-492.
O'Toole T., Mair M., Inglesby T.V. Shining Light on "Dark Winter"
Clinical Infectious Diseases. 2002;v.34, N 7. http://www.journals.uchicago.edu/CID/journal/issues/v34n7/020165/020165.web.pdf
Web-Атлас: "Окружающая среда и здоровье населения России".1998; http://sci.aha.ru/ATL/
Inglesby T.V., et al Antrax Anthrax as a Biological Weapon Medical and Public Health Management. JAMA, 1999,Vol 281, No. 18 P. 1735-1745.
Seper J. FBI subpoenas anthrax research samples THE WASHINGTON TIMES, 2002 http://www.washtimes.com
Broad W.J, The Spores Terror Anthrax Linked to Type Made by U.S.[Maybe –GB]. NY TIMES, Dec, 2001
В поисках лица «террористической национальности».
Знание-Сила 2002, №1. http://www.znanie-sila.ru/online/issue_1521.html
Kortepeter M.G. ParkG.W. Potential Biological Weapons Threats. Emerg Infect Dis. 1999. Vol. 5, No. 4, p.423-427.
Plague in India. Disease Outbreaks Reported.WHO 2002. http://www.who.int/disease-outbreak-news/n2002/february/20february2002.htm
WHO Report on Global Surveillance of Epidemic-prone Infectious Diseases WHO/CDS/CSR/ISR/2000.1 http://www.who.int/emc-documents/surveillance/docs/whocdscsrisr2001.html/plague/plague.htm
Супотницкий М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии. - М.: Вузовская книга, 2000. - 376 с.
Inglesby T.V. et al. Plague as a Biological Weapon. Medical and Public Health Management JAMA, 2000, Vol. 283, No. 17. p.2281-2290.
Filoviruses In Nonhuman Primates: Overview Of The Investigation In Texas. СDC 1998. http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/virlfvr/ebola528.htm
Свальнов С. Свальнова С. Биотерроризм. Вирус на тропе войны. Медицинская газета 2001, № 80 http://medgazeta.rusmedserv.com/2001/80/zdr.htm
EBOLA HAEMORRHAGIC FEVER.WHO. 2000. FactSheet N°103. http://www.who.int/inf-fs/en/fact103.html
Disease Outbreaks Reported Ebola haemorrhagic fever in Gabon - Update 19.WHO 2002. http://www.who.int/disease-outbreak-news/n2002/march/6march2002.html
History of Bioterrorism. A chronological History of Bioterrorism and Biowarfare Throughout the Ages. Biological Terrorism. Response Manual.2001 http://www.bioterry.com/History_of_Biological_Terrorism.asp
'Flaws' in bioterror defence BBC News, 2001. http://news.bbc.co.uk/hi/english/health/newsid_1591000/1591323.stm
Wheelis M. Investigating Disease Outbreaks under a Protocol to the Biological and Toxin Weapons Convention. Emerging Infectious Diseases 2000, v. 6, N. 6, p.595-600. http://www.cdc.gov/ncidod/eid/vol6no6/wheelis.htm
Carus W.S. Working paper. Terrorism and Biocrimes. 1998, 2001 Revision. Center for Counterproliferation Research. National Defence University. P.215.
Public health response to biological and chemical weapons. WHO guidance. WHO. 2001 http://www.who.int/emc/book_2nd_edition.htm#prepublication
Зайцев К. Новости Медицины. Больничный Leader. http://www.medlinks.ru/article.php?sid=1470&mode=thread&order=0&thold=0
ЕС готовится к борьбе с биотерроризмом , 2002. MIGNews.com http://mignews.com/news/politic/world/bioterror1511.html
Новости медицинского мира. Канада. Оттава, 2001. Медицинский вестник 2001 http://www.medvestnik.ru/News/2001/Nov/08/08-11-01-1.htm
Карлос Ярнос. Сотрудничество с НАТО. Объединенная Европа опасается биотерроризма в сфере производства продуктов питания на сайте ИноСМИ.Ru http://www.inosmi.ru/print/1003930982.html.

3. Биотехнология как компонент биобезопасности.
Современная биотехнология – одна из ключевых высоких технологий, определяющих научно-технический прогресс в начале нового столетия. По определению Европейской федерации биотехнологии (EFB), биотехнология связана с применением потенциала биохимии, микробиологии, молекулярной биологии и инженерных дисциплин для утилизации в промышленных масштабах культур микроорганизмов, клеток и тканей растений, животных и человека или частей их. Под понятием "современная биотехнология" в настоящее время подразумевают чаще всего два наиболее крупных ее направления - генетическую и клеточную инженерию, которые охватывают основную часть этой сложной междисциплинарной технологии и имеют наиболее широкие потенциальные области применения.
Возникновение новейшей биотехнологии, в первую очередь генной и клеточной инженерии, сделало возможным обеспечение таких ключевых невоенных аспектов безопасности, как здравоохранение и полноценное питание.
Работы по генетической реконструкции, или генной инженерии, начались не более 30 лет тому назад, однако события разворачиваются настолько стремительно, что даже профессионалы, думая о возможностях биотехнологии, не могут точно представить даже сравнительно близкие её перспективы. Уже сегодня биотехнология вносит вклад в улучшение здравоохранения, увеличение производства продуктов питания, восстановление лесов, повышение производительности в промышленности, обеззараживание воды и очистку опасных отходов, а в ближайшие десятилетия она займет лидирующее положение и, возможно, определит лицо цивилизации XXI века
Биотехнологическим способом производят генно-инженерные белки (интерфероны, инсулин, вакцины против гепатита и т. п.), ферменты для фармацевтической промышленности, диагностических средств для клинических исследований (тест-системы на наркотики, лекарства, гормоны и т. п.), витамины, биоразлагаемые пластмассы, антибиотики, биосовместимые материалы. Ферментные препараты находят широкое применение в производстве пива, спирта, стиральных порошков, в текстильной и кожевенной промышленности. Особая роль отводится сельскохозяйственной биотехнологии, а это - создание и культивация трансгенных растений, микробиологический синтез средств защиты растений, производство кормов и ферментов для кормопроизводства. Для России особенно актуальны такие направления, как ресурсная биотехнология - использование биосистем для разработки полезных ископаемых и биотехнологическая (с использованием бактериальных штаммов) переработка промышленных и бытовых отходов, очистка сточных вод, обеззараживание воздуха. (Белоконева О., 2001)
3.1. Здравоохранение.
Основным прикладным итогом разработок явилось создание генетических технологий для медицины, широко проникших в диагностику, лечение и профилактику болезней. На их основе принципиально изменились подходы к расшифровке патогенеза многих болезней, и создалась основа для нового направления, названного молекулярной медициной. Сейчас уже вошли в клиническую медицину такие понятия, как доклиническая (предсказывающая) диагностика, преконцепционная профилактика, генодиагностика и генотерапия. Можно сформулировать ближайшие цели и задачи дальнейшего развития генетики человека, наиболее важные с общебиологической и медицинской точек зрения. Среди таких задач на первое место можно поставить функциональную геномику. Без знания функциональных (системных) связей между элементарными единицами генома или их первичными продуктами невозможно понять онтогенез, функционирование клетки, ткани, органа (выделение секрета, морфогенез, инволюция, злокачественное перерождение, старение и т.д.). Большие задачи стоят перед сравнительной геномикой, разработка которой позволит понять эволюцию человека и популяционные закономерности распространения наследственных болезней. В анализе генетического полиморфизма необходим переход от структурного (ДНК-ового) подхода к биохимическому. Детализация биохимического полиморфизма и установление на этом уровне «генотип-фенотип» корреляций обеспечит направленную фармакотерапию через фармакогенетику. (Бочков Н.П., 2001).
Первыми продуктами новейшей биотехнологии, предназначенными для практического применения вне лабораторий, были белки для применения в медицине. При оценке таких лекарств преобладал прагматический подход – учитывалось соотношение риска и потенциальной пользы для пациента, которое часто оказывалось благоприятным для новых продуктов. Эти лекарства и средства диагностики помогают бороться с различными болезнями, сохраняя жизнь и здоровья многим больным. Идет интенсивный поиск и испытание новых препаратов, в том числе и от таких опаснейших болезней, как сердечно-сосудистые заболевания, различные формы рака, туберкулез, СПИД и другие инфекции.
Использование методов генной инженерии особенно велико в диагностике заболеваний людей и поиске путей успешного их лечения. В качестве примера можно привести получение биотехнологическими методами искусственного гормона роста человека. Нарушение его выработки в организме приводит к появлению карликов, лилипутов. Сейчас эта проблема решается введением в организм искусственного гормона роста.
Формируется генная терапия — исправление наследственных дефектов клеток организма человека путем введения в нее нормального генетического материала. Генотерапия исключительно перспективна, уже сейчас медицине известно до 4 тыс. наследственных болезней.
3.1.1. Генная терапия.
Быстрому развитию генной терапии, несомненно, способствовали результаты, полученные в ходе выполнения международного проекта «Геном человека», который был начат в 1988 г. Это один из самых трудоемких и дорогостоящих проектов в истории науки. Если в 1990 г. на него было потрачено около 60 миллионов долларов в целом, то в 1998 г. одно только правительство США израсходовало 253 миллиона долларов, а частные компании – и того больше. В проекте задействованы несколько тысяч ученых из более чем 20 стран. С 1989 года в нем участвует и Россия, где по проекту работает около 100 групп.
Основная цель первого этапа проекта – выяснить последовательность нуклеотидов во всех молекулах ДНК человека и установить локализацию, т.е. полностью картировать все гены человека. Ожидается, что на следующем этапе исследователи определят все функции генов и разработают возможности использования полученных данных, которые будут использованы в генно-терапевтических работах для лечения и предупреждения наследственных болезней.
Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммуннодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). 14 сентября 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1 : 100 000), были пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма (ex vivo) геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор).
Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3-5 месяцев (Culver R.W., 1994). За три года терапии в общей сложности проведены 23 внутривенные трансфузии ADA-трансформированных Т-лимфоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций. Столь же успешным оказалось и лечение второй пациентки с этим заболеванием. В настоящее время клинические испытания генной терапии этого заболевания проводятся в Италии, Франции, Великобритании и Японии.
В 1997 году число допущенных к клиническим испытаниям протоколов уже составляло 175, более 2000 пациентов приняли участие в их реализации. в 1999 году - около 400 клинических исследований, в которых приняли участие немногим более 3 тыс. человек. Большинство таких проектов (около 80%) касаются лечения онкологических заболеваний, а также ВИЧ-инфекции (СПИДа). ( БАРАНОВ В.С. , 1999).
Большая часть генно-терапевтических работ находится пока на I или совмещенном I/II  этапе клинических испытаний. (Зеленин А.В.,2000).



Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии). Трансфекция может проводиться с использованием чистой ("голой" - naked) ДНК, легированной (встроенной) в соответствующую плазмиду, или комплексированной ДНК (плазмидная ДНК, соединенная с солями, белками (трансферрин), органическими полимерами (DEAE-декстран, полилизин, липосомами или частицами золота), или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных способности к репликации.
При генной терапии чаще всего используют метод внесения терапевтического гена. Разрабатывают также методы коррекции дефектных генов (при мутациях, изменяющих небольшой участок ДНК), замены дефектного гена нормальным, методы усиления экспрессии нормального гена, восстановления экспрессии блокированного гена или методы блокады экспрессии болезнетворного гена.
Для введения терапевтического гена в клетки пациента используют специальные вектора. При этом одной из самых сложных проблем является разработка подходов, обеспечивающих специфическую, эффективную и безопасную доставку генетического материала  в соответствующие клетки-мишени пациента. Проблема доставки гена значительно усложняется в тех случаях, когда необходимо перенести большой ген (вектора имеют ограниченную емкость), особенно в клеточное ядро. Правильное внесение гена обеспечивает его функционирование в течение всей жизни человека и полное излечение пациента от соответствующего заболевания.
В качестве векторов могут быть использованы ослабленные и модифицированные вирусы (ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы, вирус герпеса и др.) или синтезированные векторы, способных переносить гены реципиенту. Для клинического применения векторы должны обладать определенными качествами. Однако универсального вектора не существует. Любой вектор имеет свои преимущества и недостатки. Одни векторы легко проникают в делящиеся клетки, но не способны инфицировать клетки, находящиеся в состоянии покоя (ретровирусы); другие — могут вызывать иммунный ответ на вирусные белки, тем самым приводя к быстрой элиминации (гибели) внесенного генетического материала из организма (аденовирусы); третьи — способны проникать в неделящиеся клетки, но могут представлять потенциальную опасность для человека (лентивирусы, например, ВИЧ); четвертые — непатогенны, могут инфицировать неделящиеся клетки и обеспечивать достаточно длительную экспрессию внесенных генов, но они не могут переносить большие участки ДНК и их трудно получить в большом количестве (адено-ассоциированные вирусы); пятые — неиммуногенны, могут доставлять большое количество генетического материала в организм человека, но значительно меньшее — внутрь клеточного ядра, к тому же относительно быстро разрушаются в организме или перенесенный ген экспрессируется кратковременно (липосомы).
Выбор вектора и метода его доставки определяется конкретной целью генной терапии,  поскольку от характера заболевания зависит, в клетки каких тканей необходимо ввести гены, как долго и в каком количестве они должны экспрессироваться и др. Использование векторов в клинических испытаниях демонстрируют таблицы:

(Зеленин А.В.,2000)
В качестве клеток-мишеней использовали лимфоциты, клетки костного мозга, солидных опухолей, печени, легких, сердца, скелетных мышц и др. В последующих клинических исследованиях стали применять различные подходы in vivo, используя для переноса генетического материала в организм реципиента все возможные пути введения (всего в клинических исследованиях использовано 18 разных путей введения).
Прямая инъекция генетического материала – самый простой метод доставки трансгена в клетки in vivo, при котором ДНК вводится непосредственно в ткань путем инъекции. Область использования данного метода ограничена такими тканями, как кожа, тимус и поперечно-полосатые мышцы, некоторыми так называемыми солидными опухолями. Достаточно продолжительная (до года) экспрессия трансгена наблюдается преимущественно в мышечной ткани. Эффективность такой трансфекции обычно низкая (менее 1%), но вполне достаточная, например, для генетической иммунизации.
Баллистическая трансфекция основана на обстреле органов и тканей микрочастицами тяяжелых металлов (золото, вольфрам), покрытых плазмидной ДНК. Микрочастицы проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в ядра клеток. Глубина проникновения, как правило, невелика – до 1мм, поэтому метод используется преимущественно для трансфекции клеток кожи и подлежащего хряща. Однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить ген в волокна поперечно-полосатых мышц.
Введение генетического материала внутрь кровеносных сосудов, питающих трансфицируемый орган применяется в первую очередь для лечения болезней печени, почек и мочевыводящих путей. Аэрозольное введение генетического материала в дыхательные пути используется при лечении заболеваний легких. (А.В.Зеленин, 2000).
Таким образом, стандартная схема генокоррекции наследственного дефекта включает серию последовательных этапов. Она начинается созданием полноценно работающей (экспрессирующейся) генетической конструкции, содержащей смысловую (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обеспечивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем проводится трансфекция (перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценивается эффективность трансфекции, степень коррегируемости первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro) и, что особенно важно, in vivo на животных - биологических моделях. Только после этого можно приступать к программе клинических испытаний. С точки зрения генной терапии, самыми простыми болезнями являются моногенные болезни, те, которые требуют работы с одним геном, например, гемофилия, мышечная дистрофия Дюшенна, серповидно-клеточная анемия. Имеются данные о разработке экспериментальных подходов и проведении предклинических и клинических испытаний методов генной терапии почти 30 моногенных заболеваний человека. Однако в первых клинических исследованиях не удалось достичь продолжительного терапевтического эффекта (за исключением применения генной терапии у больных с наследственным дефицитом фермента аденозиндезаминазы).
В ходе клинических исследований часто возникали определенные проблемы: векторы не всегда достигали нужных клеток, перенос генов был неэффективен или их экспрессия недостаточно продолжительна для достижения терапевтического эффекта, часто развивался клеточный или гуморальный иммунный ответ на вирусные или чужеродные белки, что требовало введения повторных доз генетического материала, и др. Выявленные недостатки и возникшие проблемы вызвали необходимость проведения фундаментальных, более целенаправленных клинических исследований. В результате моногенным заболеваниям посвящено лишь около 10% общего числа протоколов генной терапии.
Более сложными являются исследования в направлении ряда приобретенных заболеваний, развитие которых обусловлено комплексным взаимодействием генов и воздействием факторов окружающей среды— диабета, остеопороза, ревматоидного артрита, рака и даже СПИДа. Результаты первых клинических испытаний этих подходов оказались в высшей степени обнадеживающими, в особенности при лечении нейродегенеративных и онкологических заболеваний нервной системы. Значительная часть клинических исследований посвящена лечению больных со злокачественными новообразованиями (около 64% от числа всех исследований), с наследственными моногенными болезнями (13%) и инфекционными заболеваниями (8%), в частности СПИДом.













В настоящее время наибольшее распространение получила генная терапия опухолевых заболеваний, по-видимому, из-за огромного множества раковых заболеваний в мире. С другой стороны в отношении тяжелых, часто безнадежных раковых больных утрачивают своё значение такие соображения, как отдаленный риск генетических повреждений
Специалисты полагают, что перспективная технология генной терапии СПИДа, например, позволит значительно сократить расходы на широко используемое в настоящее время противовирусное лечение, которое далеко не всегда эффективно и нередко сопровождается серьезными осложнениями.
Разрабатываемые методы генной терапии направлены на устранение повторных инъекций лекарственных препаратов, что является существенным преимуществом для пациента, в том числе экономического характера.
Сейчас разрабатывается метод генной терапии, при которой вектор будет содержать ген, кодирующий продукцию какого-либо белка, а также молекулярную структуру, которая способна регулировать экспрессию гена в зависимости от приема внутрь специального лекарственного средства.
В кардиологии разрабатывают методы использования аденовирусных векторов для переноса генов, способных вызывать гиперплазию миоцитов в клетки миокарда пациентов, перенесших инфаркт. Однако повреждение клеток в результате прямого введения генетического материала в миокард, а также индукция клеточного иммунного ответа на антигены аденовируса пока препятствуют внедрению этих методов в клиническую практику.
Для лечения ишемической болезни сердца перспективен метод генной терапии, направленный на стимуляцию образования новых кровеносных сосудов (ангиогенез). На стадии эмбрионального развития в процессах ангиогенеза может участвовать множество факторов роста. Однако у взрослого человека ангиогенные факторы в основном продуцируются при заживлении ран, а также при некоторых патологических процессах (росте злокачественных опухолей или при диабетической ретинопатии). При разработке методов ангиогенной генной терапии изучают факторы роста, которые можно использовать для активации ангиогенеза. Для лечения больных с солидными злокачественными опухолями, наоборот, разрабатывают методы подавления ангиогенеза посредством ингибиции выработки эмбрионального фактора роста, стимулирующего ангиогенез.
Разработана систему, несущую ген, который кодирует продукцию одного из факторов системы свертывания крови. Введение такого вектора внутримышечно больным гемофилией предупреждает возникновение кровотечений. Результаты первых клинических исследований свидетельствуют, что после такого лечения пациенты с гемофилией более года не испытывают необходимости в инъекциях фактора. (Kaufman R.J. Advances toward gene therapy for hemophilia at the millennium//Hum.Gene Ther.1999.V.10.P.2091-2107). В настоящее время на проведение курсов заместительной терапии для одного больного гемофилией А или в США ежегодно затрачивают 100 тыс. долларов. Если новый метод лечения позволит пациентам обходиться без инъекций в течение 5-10 лет, то экономическая выгода от проведения генной терапии несомненна. (Зеленин А.В., 200; БАРАНОВ В.С.,1999).
Единственным и непременным ограничением, сохраняющим свою силу в современных условиях, при применении генной терапии для лечения многих заболеваний является то, что все генотерапевтические мероприятия должны быть направлены только на конкретного больного и касаться исключительно его самого. Принципиально, наследственные болезни можно было бы вылечить раз и навсегда, воздействуя на половые клетки или вводя здоровые гены в клетки зародыша, так, чтобы они передавались по наследству. Методы генной терапии позволяют лечить различные генетические патологии в период внутриутробного развития плода. Введенный ген, попадая во множество интенсивно делящихся клеток, предотвращает развитие заболевания. Однако современный уровень знаний не позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровне половых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей человека в связи с реальной опасностью засорения генофонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесением мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества. Вместе с тем в научной литературе все чаще и настойчивее раздаются призывы к возобновлению дискуссии о целесообразности генокоррекции зародышевых и половых клеток человека.
Поскольку использование генной терапии служит темой многих религиозных, этических и медицинских споров, Совет Европы еще в 1996 году подписал конвенцию о защите прав и достоинства человека в связи с приложениями биологии и медицины. В одном из четырех пунктов этой конвенции, который касается интервенции в геном человека, подчеркивается, что всякое изменение генома может производиться только на соматических клетках. Кроме того, "Конвенция о правах человека и биомедицине" содержит запрет на селекции по половому признаку. В России для регламентации вопросов этики генной инженерии и геномики вообще в 1998 году принят закон «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности».
Возможности исправления генетических дефектов, радикального избавления от любых болезней, которые открывает эта область науки, имеют колоссальное значение для медицины, а следовательно, для фармацевтических и биотехнологических компаний. В настоящий момент усилия биотехнологических компаний направлены на составление тестов для выявления поврежденных генов у людей с определенными заболеваниями или у тех, для кого велик риск развития этих заболеваний. Однако в самое ближайшее время основное внимание в коммерческой сфере сместится с диагностики в сторону создания методов генной терапии. Препараты будущего не станут разрабатываться обычным методом проб и ошибок. Знания о последовательностях и функциях генов и белков позволят создавать лекарства, действие которых будет нацелено на определенные области организма. Следовательно, у них будет гораздо меньше побочных эффектов, чем у современных медикаментов.
Многими фармацевтическими компаниями для производства лекарственных препаратов используется уже сегодня технология рекомбинантной ДНК. На фармацевтическом рынке к таким препаратам относятся, например, рекомбинантные аналоги человеческого инсулина и соматотропина (гормон роста) компаний Eli Lilly, Novo Nordisk, Hoechst, Berlin-Chemie, Pharmacia, эритропоэтин компании Janssen-Cilag. Все подобные современные высококачественные препараты, однако, имеют одно существенное неудобство для больных. Они предназначены для систематического введения пациентам путем иъекций. При генной терапии (и такие методы разрабатываются) пациенту можно ввести ген, который отвечает за дефицитный для организма белок, например инсулин, и необходимость повторных инъекций лекарства исчезает.
В заключение следует отметить, что за короткий период существования генной терапии выполнен огромный объем экспериментальных работ, а также проведены первые клинические исследования, что значительно укрепило её научную базу. Сегодня многие специалисты считают, что вопрос не в том, будут ли достигнуты значительные клинические успехи в результате проведения генной терапии, а в том, когда это произойдет. (C.Купцова. 2001).
















За рубежом генная терапия и генодиагностика развиваются интенсивно и по уровню финансирования занимают третье место после исследований в области рака и СПИДа. К сожалению, из всех проектов по генной терапии, утвержденных Американским и Европейским комитетами по генной терапии, нет ни одного проекта из России или стран СНГ. Тем не менее, научные работы в этой области ведутся и в нашей стране. В России в настоящее время имеется ограниченное число лабораторий и центров, занимающихся технологиями генной терапии. Для исправления этого положения в рамках подпрограммы "Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении" в 1996 году было создано новое направление "Генотерапия". Работы по генной терапии проводятся в Институте акушерства и гинекологии имени Д. О. Отта РАМН, в Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН, Институте молекулярной генетики РАН, Институте биологической и медицинской химии РАМН, Научном центре медицинской генетики РАМН, в институтах Новосибирска. Хотя безусловно надо признать, что вклад отечественной науки в общее развитие этого направления биомедицины исчезающе мал.
Таким образом, генетическая революция, апофеозом которой явилась генотерапия, не только предлагает реальные пути лечения тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и в своем стремительном развитии ставит перед обществом новые проблемы, решение которых настоятельно необходимо уже в ближайшем будущем.
3.1.2.Клеточная терапия.
Близок к генной терапии ex vivo подход, основанный на введение в организм больного клеток здорового человека или животного, содержащих нормально функционирующий ген, отсутствующий или поврежденный у пациента. Однако здесь речь идет, скорее, не о генной, а о клеточной терапии, или трансплантологии.
Программа "Геном человека" показала, что человек отличается от обезьян и других млекопитающих генами эмбриогенеза, которые отвечают за раннее развитие зародыша из эмбриональной стволовой клетки. В отличие от всех живых существ, передняя доля мозга человека уже на ранних стадиях перестает контролироваться генами, определяющими количество клеток в том или ином органе. Формирующиеся в процессе развития мозга новые нейроны мигрируют, создавая новые клеточные образования.
Благодаря новым генам мозг зародыша человека и других млекопитающих приобрел и новый орган - нервный гребень. Стволовые клетки нервного гребня (СКНГ) являются самообновляющимися мультипотентными предшественниками, они могут генерировать один или более классов нейронов, глию и миофибробласты in vitro. Из мигрирующих клеток гребня образуются вся костно-мышечная система лица, тимус, все элементы внутреннего уха, проводящая система сердца, периферическая нервная система, надпочечники.
Дочерняя клетка, вступившая на путь дифференцировки называется "transient amplifying cell". Такие клетки делятся более часто, чем стволовые, но обладают ограниченным пролиферативным потенциалом и рассматриваются как инициальная ступень на пути к терминальной дифференцировке. Они дифференцирутся в пост-митотические клетки и, наконец, в терминально диференцированные клетки, неспособные к делениям.

 
Впервые во внутриутробном развитии человека эмбриональные стволовые клетки появляются на 5-7-й день после оплодотворения. Они образуют комочек внутри бластоциста - шарика, состоящего из 140 клеток. На снимке показаны бластоцисты человека, полученные путем оплодотворения в пробирке. Скопление стволовых клеток хорошо видно у стенки бластоциста в левом нижнем углу фотографии.( В. Репин, 2001г.).
Впервые животную стволовую эмбриональную клетку из зародыша мыши удалось выделить в 1981 году. На выделение эмбриональной стволовой клетки из человеческого зародыша понадобилось еще 17 лет. В 1999 году журнал "Science" признал выделение эмбриональных стволовых клеток человека третьим по важности событием в биологии ХХ века. Эмбриональная стволовая клетка оказалась прекрасной моделью для понимания того, как 5000 генов эмбриогенеза тиражируют генетическую информацию, чтобы из одной клетки вырос человеческий организм, состоящий из 1014 клеток.

Схема получения "запчастей" из эмбриональных стволовых клеток. После оплодотворе ния яйцеклетка начинает делиться и дает сначала 2, потом 4, а затем и 140 клеток, образующих шарик-бластоцист. Его наружную оболочку разрушают вручную (микромани пулятором) или ферментами, получая стволовые клетки. Содержа в культуре, их можно размножать и вызывать превращение в специализированные клетки организма - нервные, мышечные, печеночные, кожные и т. д., которые затем пересаживают больному взамен таких же отмерших или заболевших его собственных клеток. ( В. Репин., 2001г.)
Эмбриональные стволовые клетки могут принять любую программу и превратиться в один из сотен возможных типов зародышевых клеток. Удивительная способность эмбриональной стволовой клетки стать любой клеткой организма продиктована наличием в ней избытка РНК всех генов, отвечающих за рост зародыша на ранней стадии развития эмбриона. Это означает, что основной функцией стволовой клетки является перенос мРНК в следующее клеточное поколение.
Изучение путей превращения эмбриональной стволовой клетки особенно важно для медицины, т.к., зная их, можно вырастить из клеток-предшественников огромный массив ткани и, в принципе, любой человеческий орган. При пересадке эмбриональных стволовых клеток в какой-либо орган из них всегда образуются только клетки этого органа, что позволяет использовать эмбриональные стволовые клетки для восстановления поврежденных органов и тканей, лечения множества тяжелых заболеваний.
Клеточная терапия уже миновала стадию научного эксперимента и вошла в практику во многих странах. Особенно перспективна эмбриональная клеточная терапия для лечения таких тяжких недугов, как атеросклероз, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, болезни суставов. Список заболеваний велик и включает в себя и те, которые практически не поддаются лечению с помощью медикаментов.
Трансплантация органов и тканей для многих людей - единственный шанс выжить. Но даже в США эти операции делают менее чем одному из четырех пациентов, нуждающихся в них. Остальные умирают из-за отсутствия совместимой донорской ткани. Количество клеточных трансплантаций в 12 развитых странах Европы достигло 16 операций на миллион человек. В странах СНГ адекватную хирургическую помощь получают единицы нуждающихся в трансплантации. Именно поэтому трансплантация эмбриональных клеток человека рассматривается в качестве альтернативы пересадки целого органа.
В настоящее время в США насчитывается 1045 банков клеток и тканей человека, объединившихся в 1976 году в Американскую ассоциацию тканевых и клеточных банков. В Англии исследования с фетальными тканями человека официально ведутся с 1957 года под эгидой Медицинского исследовательского банка тканей. Во всех крупных городах Швеции, Германии, Канады созданы банки фетальных тканей и стволовых клеток.
(В. Репин, 2001; И.А. Кривцова, 2001; http://www.ixs.nm.ru/clo5.htm; http://nauka.hotmail.ru/medicine/cells.html).
Трансплантация гемопоэтических эмбриональных клеток - это мощный метод лечения, имеющий многочисленные аспекты приложения: в онкологии, хирургии, гематологии, клинической иммунологии, эндокринологии, кардиологии, терапии, психиатрии, акушерстве, неврологии и нейрохирургии. С его помощью можно лечить сотни различных заболеваний.
Только в гематологии с помощью стволовых клеток можно лечить анемии, лейкемии, лейкозы и прочие гематологические болезни. Из стволовых клеток человека, выделенных из зародыша возрастом 5 дней, удалось получить красные и белые кровяные тельца, а также тромбоциты. Полученная таким образом кровь способна стать идеальной для переливания, поскольку она заведомо "чиста" от вирусов и бактерий. Кроме того, на основе этой технологии можно создать кровь, по своим характеристикам наиболее подходящую пациенту. Более того, с помощью стволовых клеток можно создать практически бесконечные источники крови и ее компонентов и забыть о проблемах с донорской кровью. (Nature, 2001).
Использование мощного иммуномодулирующего воздействия клеточной терапии в предоперационный период позволяет провести оперативное вмешательство, избежав ранних и поздних осложнений, добиться более полной хирургической реабилитации.
Ученые подошли очень близко к созданию метода лечения болезни Паркинсона с помощью стволовых клеток, отобранных у эмбрионов. (Nature Medicine, 2001).
Несмотря на то, что исследования в области эмбриональных клеток сулят ученым грандиозный прорыв во всех отраслях биологии и медицины, в США и Германии они сейчас "заморожены", но продолжают проводиться в Англии, Японии, Австралии и многих других развитых странах. Основная причина запрещения научных исследований – этическая, т.к. основной источник эмбриональных клеток - материал, остающийся от искусственного оплодотворения, и фетальная ткань от медицинских абортов. Католическая церковь, религиозные общины, различные общественные организации, которые борются за запрещение абортов, оказывают колоссальное давление на правительства и президентов, призывая вместе с абортами запретить и исследование эмбриональных стволовых клеток, и лечение с их применением.
Тем не менее правительство Швейцарии разрешило ученым проводить изучение стволовых клеток при условии, что эти исследования будут находиться под жестким правительственным контролем и не будут проводиться в коммерческих целях. Ученые отныне смогут импортировать линии стволовых клеток из Америки, а также использовать европейские линии. Главной целью поправок к предыдущему законодательству является сохранение швейцарских приоритетов в этой области исследований. Основными ограничениями исследований являются использование стволовых клеток, полученных бесплатно и легальным путем из стран, где они были получены для целей искусственного оплодотворения с разрешения доноров.
9 августа 2001 года президент США одобрил выделение федеральных средств (до 200 млн. дол.) на ограниченные исследования стволовых клеток, выделяемых из человеческих зародышей. Медицинские исследования будут проводиться только с линиями стволовых клеток из уже разрушенных эмбрионов (гл. образом материал после выкидышей и абортов).
В последние годы возникло новое направление в медицине - изучение так называемых стволовых стромальных клеток, находящихся в костном мозге. Они обеспечивают восстановление поврежденных участков органов и тканей, залечивают любую рану, превращаясь на месте повреждения в необходимые организму клетки: костные, гладкомышечные, печеночные, сердечной мышцы или даже нервные.
В костном мозге новорожденного человека на 10 тысяч стволовых кроветворных клеток приходится одна стромальная клетка. У подростков стромальных клеток уже в 10 раз меньше. К 50-ти годам на полмиллиона стволовых - одна стромальная клетка, а в 70 лет - всего лишь одна стромальная клетка на миллион стволовых. Донорские стромальные клетки удобнее всего получать прямо при рождении из пуповины и плаценты, где они тоже содержатся в достаточном количестве. Можно ожидать, что промышленными источниками стромальных клеток в скором будущем станут пуповины, плаценты и жировая ткань, т.к. показано, что стромальные клетки можно получать из клеток жировой ткани (адипоцитов).


Состав стволовых клеток - предшественников всех клеток организма.
Большая часть стволовых клеток взрослого организма находится в костном мозге. Как известно, костный мозг, прежде всего, - плацдарм кроветворения. Он состоит из двух видов стволовых клеток: тех, из которых получается все известное многообразие клеток крови (так называемые гемопоэтические стволовые клетки), и стромальных стволовых клеток. Помимо костного мозга небольшое количество стволовых клеток (так называемые стволовые тканевые клетки) имеется непосредственно в тканях: мышечной (мио-бласты), костной (остеобласты) и других.
В кроветворной системе стволовых клеток много, они просты по структуре, хорошо изучены, постоянно обновляются, и пути их превращений в клетки крови давно известны.
По сравнению с гемопоэтическими стромальных клеток костного мозга совсем немного, и они представляют собой более сложные долгоживущие системы, которые обновляются достаточно редко. Пути превращения стромальных клеток только начинают изучать. Как показали исследования, стромальные клетки, так же как и предшественники клеток крови, постоянно циркулируют в кровотоке млекопитающих


Эксперимент в пробирке с человеческими стволовыми клетками, взятыми из костного мозга, продемонстрировал возможность превращения их в клетки кровеносных сосудов. Более того, при инъекции этих клеток в организм крыс, переживших инфаркт, происходила их миграция к месту повреждения ткани сердца и начиналось образование новых кровеносных сосудов. В другом исследовании удалось продемонстрировать, как из стволовых клеток костного мозга мышей образовались клетки сердечной мышцы. Ученые надеются, что стволовые клетки из костного мозга можно будет применять для устранения повреждений после инфаркта. Кроме того, использование собственных стволовых клеток пациентов позволит снять вопрос об использовании для этой цели эмбрионов.
В терапевтическом применении стромальных клеток сегодня, без сомнения, лидирует ортопедия. Дело в том, что в руках у медиков имеются уникальные вещества: особые белки, так называемые bone morphogenic proteins (BMP), вызывающие перерождение стромальных клеток в клетки костной ткани (остеобласты). На выделение и изучение свойств BMP у исследователей ушло почти четверть века. Результаты клинических испытаний впечатляют. (В.Смирнов,2001).
В отличие от эмбриональных стромальные стволовые клетки - проверенный природой собственный восстановительный резерв организма. Риск иммунного отторжения собственных стромальных клеток отсутствует, да и возможность их злокачественного перерождения минимальна. Применение стромальных клеток безупречно и с морально-этической точки зрения. Вот почему стромальные клетки должны стать основой восстановительной медицины будущего столетия.
Ученые настаивают на том, что они нашли замену клонированию, и нет необходимости давать "зеленый свет" не до конца пока понятому и поэтому опасному клонированию.
3.1.3. Генопрофилактика.

С появлением методов генетической инженерии, открывших реальную возможность встройки в геномы вирусов чужеродных генов, направляющих синтез желаемых белков, стало возможным получение живых рекомбинантных вакцин. В 1980 году проведены первые генно-инженерные эксперименты на вирусе простого герпеса человека, в 1981 году – на аденовирусе человека, а в 1982 году – на вирусе осповакцины. Возникла идея конструирования гибридных вирусов, способных при заражении человека или животных синтезировать не только свои белки, но и протективные белки других патогенных вирусов, для которых нет эффективных вакцин. Такие гибридные вирусы получили название живых поливалентных вакцин.
Живые вакцины индуцируют не только антительный (гуморальный) иммунный ответ в инфицируемом организме, но и имеющий важное значение для защиты от вирусной инфекции T-клеточный иммунный ответ. Цитотоксические T-лимфоциты продуцируются только в ответ на антиген, синтезируемый эндогенно в клетках организма и не продуцируются при введении этого же антигена экзогенно, т.е. в составе убитой вакцины или в виде индивидуального белка. Поэтому разработка живых поливалентных противовирусных вакцин открывает новые, ранее не доступные возможности иммунопрофилактики различных инфекционных заболеваний. Вирусы, в геном которых встраивают чужеродные гены, называют векторными вирусами или просто векторами. Несомненно, что при создании живых поливалентных вакцин в качестве векторных наиболее целесообразно использовать вирусы, уже применяемые в качестве живых вакцин. Живые рекомбинантные вакцины были получены, помимо выше перечисленных, на основе вакцинного штамма вируса желтой лихорадки, вакцинного штамма африканской чумы свиней, вакцинного штамма вируса полиомиелита и некоторых других. Эти вакцины обещают быть намного более дешевыми, чем существующие инактивированные вакцины и тем самым могут заложить основы к долговременному и комплексному искоренению распространенных антропонозных заболеваний человека.
Технология ДНК-вакцин на основе введения в организм неразмножающихся молекул ДНК (плазмидных векторов), содержащих гены основных антигенов вирусов и способных после инъекции экспрессировать их в клетках организма человека с целью выработки эффективного и долговременного иммунного ответа –другой путь получения вакцин нового поколения. Начало этой технологии было положено работами Танга с соавторами в 1992 году. Ее перспективность была подтверждена последующими исследованиями (Feltquate D.M., 1998). Показано, что при разных способах введения (внутрикожно, внутримышечно, внутривенно) гибридная плазмида может проникать в клетки и достаточно долго сохраняться в организме. Целевой белок, кодируемый гибридной плазмидой, продуцируется в клетках, имитируя процесс биосинтеза соответствующего белка патогена. Это продемонстрировано уже для ряда патогенов, включая вирусы, бактерии и паразитов (Alarson J.B. et al., 1999; Dietrich G. et al., 1999; Huygen K., 1998; Inchauspe G., 1999; Wild T.F., 1999).
ДНК-вакцины также проявляют эффективность в лечении или предотвращении опухолей, аллергических и аутоиммунных заболеваний. В организме ДНК-вакцины индуцируют полноспектральный иммунный ответ, который включает цитолитические Т-клетки, Т-хелперные клетки и антитела. Иммунный ответ к ДНК-вакцинам может быть усилен генно-инженерным антигеном, чтобы способствовать его презентации к В- и Т-клеткам. Более того, иммунный ответ может быть модулирован генетическими адъювантами в форме векторов, экпрессирующих биологически активные детерминанты или более традиционные адъюванты, которые усиливают потребление ДНК в клетках. Легкость генетической манипуляции ДНК-вакцинами привлекает внимание их использования не только как вакцины, но и как исследовательский инструмент для иммунологов и микробиологов. ДНК-вакцины названы вакцинами третьего поколения. Доставка вакцины в ядра клеток может осуществлятся разными путями: "выстреливанием" безыгольным инжектором микробной ДНК в кожу и мышцу, с помощью жировых шариков-липосом, содержащих вакцину, которые будут активно поглощаться клетками. (Alarson J.B. et al., 1999; Kowalczyk D.W.).
К настоящему времени создано около 60 таких вакцин, более 40 из них проходят испытания на животных (в том числе против вируса СПИД, гриппа, бешенства, лимфоцитарного хориоменингита, гепатитов В и С, простого герпеса, папилломы, а также возбудителей малярии, лейшманиоза, тубркулеза).
Вакцины на основе РНК-репликонов также способны эффективно экспрессировать в клетках человека чужеродные антигены, но неспособны не только размножаться в клетках, но и встраиваться в их геном, что делает их потенциально более безопасными. Впервые такая возможность была продемонстрирована на примере вируса леса Семлики (альфавирус). Репликон этого вируса способен экспрессировать in vivo гетерологичные белки. Иммунизация мышей векторами, кодирующими антигены вируса гриппа (гемагглютинин и нуклеопротеин), привела к иммунному ответу, который защищал от заражения инфекцией вируса гриппа (Berglund P. et al., 1999). Для экспрессии и доставки ряда гетерологичных генов (оболочечного и NS3 генов вируса гепатита С, гликопротеина G вируса везикулярного стоматита, хлорамфениколацетилтрансферазы, бета-галактозидазы) исследовался флавивирус Kunnjin. В клетках BHK 21 большинство рекомбинантных KUN репликонов успешно упаковывалась в секретируемые вирусоподобные частицы. Последние могут быть успешно использованы для разработки неинфекционных и нецитопатогенных вакцин, а также для генной терапии (Varnavski A.N. et al., 1999). Появилась уникальная возможность создания безопасной вакцины против высокопатогенного вируса Марбург, для которого до настоящего времени не существует никаких вакцин. В качестве РНК-репликона использовался вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Вакцинированные ВЭЛ-репликоном, экспрессирующим белки GP и NP вируса Марбург, обезьяны продемонстрировали защищенность от последующего заражения вирусом Марбург (Hevey M. et al., 1998; Pushko P.,et al., 1999).

Одной из главных проблем медицинской науки остается форма доставки иммуногена. В этом отношении привлекательными векторами для оральной доставки вакцин являются живые аттенуированные бактериальные носители, экпрессирующие гетерологичные антигены. Этот тип доставки обладает широким спектром действия, индуцируя как системный иммунный ответ, так и ответ слизистой. В то время, как оральная субъединичная вакцина обычно требует использования адьювантных белков, таких как холерный токсин, для того, чтобы вызвать эффективный иммунный ответ, живые реплицирующиеся вектора продуцируют свои собственные иммуномодулирующие факторы in situ (например, компоненты клеточной стенки), что также является преимуществом по сравнению с другими формами введения, такими как микроинкапсуляция. Более того, использование естественных путей введения может оказаться более выгодным, поскольку многие бактерии, подобно сальмонеллам, выходят из просвета кишечника через М-клетки пейеровых бляшек В конечном счете бактерии попадают в лимфатические узлы и селезенку, таким образом позволяя доставлять вакцину к участкам иммунной системы.
Перспективным вектором является Salmonella spp., поскольку имеется обширная информация о генетике и физиологии многих штаммов. Уже имеется большой массив фактов, подтверждающих полезность сальмонелл в качестве носителей гетерологичных антигенов, способных индуцировать протективный иммунный ответ (Darji A. еt al., 1997). Безопасные аттенуированные штаммы-вакцины доступны и уже используются в качестве вакцин на людях и сельскохозяйственных животных.
Революционным направлением в современной вакцинологии является разработка вакцин на основе трансгенных растений, в геном которых был встроен соотвествующий фрагмент генома патогенного микроорганизма.
Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о широкой перспективе в разработке и практическом использовании таких вакцин. Оральный способ иммунизации является самым безопасным и доступным. Ассортимент пищевых источников растительных вакцин не ограничен. Немаловажное значение имеет высокая экономичность растительных вакцин.
Первая такая вакцина была получена в 1992 году: трансгенное растение табака стало продуцировать "австралийский" антиген. Полученный из растений и частично очищенный антиген, введенный мышам, вызывает мощный иммунный ответ подобно вакцине против гепатита В.
В 1998 году с помощью картофеля, продуцирующего В-субъединицу холерного анатоксина, была получена выраженная защита у поедавших его мышей при заражении их холерой. Аналогичаня вакцина против кори была получена на табаке.
С 1998 года испытывается картофельная вакцина, продуцирующая антигены энтеропатогенной кишечной палочки, сейчас испытываются аналогичные вакцины к вирусу Ньюарк (возбудителю диареи) и гепатиту В с обнадеживающими результатами. На животных испытываются вакцины против бешенства, выращенные на помидорах.
С учетом необходимости использовать эти "вакцинные продукты" в сыром виде, ведутся исследования по выращиванию вакцин на растениях, которые не требуют приготовления, например, на бананах (http://www.privivki.ru/immunitet/future.htm).
Одной из актуальных проблем современной вакцинологии является разработка комплексных вакцин, с помощью которых возможна иммунизация против нескольких инфекций. Вакцинировать против всех инфекций с помощью одной инъекции препарата - требование к идеальной вакцине.
Трудности создания многокомпонентных вакцин заключаются в:
физико-химической несовместимости некоторых антигенов, стабилизаторов, консервантов, адъювантов и пр.;
недостаточной стабильности многокомпонентных комбинаций из антигенов;
различной длительности приобретенного иммунитета к отдельным компонентам комплексной вакцине и сроков ревакцинаций.
В исследованиях на людях показана возможность создания активных комбинированных вакцин, состоящих из инактивированных и живых компонентов. Они могут быть сгруппированы в соответствии с совместимостью антигенов и вакцинных штаммов. Более вероятно, что в недалеком будущем в практической вакцинологии будут использоваться две основные многокомпонентные вакцины: одна живая, другая химическая (инактивированная
Для получения таких вакцин используются биодеградирующие микросферы, которые с одной стороны предохраняют антиген от вредного влияния окружающей среды, а с другой стороны распадаются и освобождают антиген в заданное время.
Микрокапсулы состоят из нетоксичных полимеров лактида или гликолида или их сополимеров. Микросферы могут быть разной величины, максимальный диаметр обычно не превышает 10 микрон. Вакцины можно вводить любым способом (парентерально, орально, интраназально и пр.).
В экспериментальных условиях испытано несколько десятков таких вакцин. С помощью микросфер можно проводить комплексную вакцинацию против нескольких инфекций одновременно: каждая капсула может содержать несколько антигенов, а для иммунизации можно брать смесь различных микрокапсул. Таким образом, микрокапсулирование позволяет значительно сократить количество инъекций при вакцинации.
Открываются новые перспективы стабильности вакцин и упрощения их транспортировки и хранения. Это становится возможным благодаря "леденцовой технологии".
Речь идет о способности сахара трегалозы сохранять живыми клетки при крайней стпени обезвоживания. Трегалоза, как и другие сахара, встречается в тканях многих организмов - от грибов, до млекопитающих. Ее особенно много в растениях пустынь. Трегалоза обладает способностью при охлаждении насыщенного раствора постепенно переходить в состояние "леденца", которое иммобилизует, защищает и сохраняет белковые молекулы. При контакте с водой леденец быстро тает, высвобождая белки.
Использование подобной технологии для сохранения вакцин позволит, прежде всего, сократить расходы на ее транспортировку и хранение, повысив термостабильность. Но с ее помощью можно создать и новые их формы, например, вакцинные иглы, которые, будучи введены в кожу, будут растворятся и высвобождать вакцину с определенной скоркостью. Возможно приготовление вакцины в виде быстрорастворимого порошка, содержащего вакцину, для ингаляции или для инъекции в кожу.
Чрезкожная иммунизация - это еще одно новшевство в производстве вакцин. Было показано, что кожные пластыри, пропитанные В-субъединицей холерного токсина, не вызывают токсического эффекта. В то же время, они активируют антиген-презентирующие клетки, находящиеся в изобилии в коже. При этом развивается мощный иммунный ответ - как антительный, так и клеточный.
Если в пластыре холерный токсин смешать с другим вакцинным антигеном, то иммунный ответ развивается и к нему. Такой путь испытавается для иммунизации против столбняка, бешенства, дифтерии, гриппа. (В.К.Таточенко, 2000; Н.В.Медуницын,1999).
3.1.4. Генодиагностика.
Практическое применение молекулярной медицины - молекулярная диагностика наследственных заболеваний на любой стадии развития организма, в том числе и до рождения (пренатальная диагностика), и определение генов предрасположенности к некоторым распространенным болезням, и геномная "дактилоскопия" - точная идентификация личности на основе анализа особенностей структуры его генома .
В геноме человека насчитывается 35-50 тысяч различных генов, изменения в некоторых из них приводят к нескольким тысячам наследственных болезней. Гены практически всех наиболее частых (около 320) и сравнительно редких (около 170) наследственных болезней уже известны. Методы их обнаружения достаточно просты и универсальны и поэтому широко применяются в медицине.
Выявление генов наследственных болезней на ранних сроках беременности (с десятой недели) позволяет предотвратить рождение больного ребенка. Впервые в нашей стране внутриутробный диагноз (гемофилия - несвертываемость крови) был поставлен в 1989 году в Санкт-Петербурге в Институте акушерства и гинекологии имени Д. О. Отта. Затем здесь же впервые в России пренатальная диагностика позволила выявить также такие тяжелейшие генные патологии, как муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, фенилкетонурия, синдром ломкой Х-хромосомы
Сейчас у нас в стране можно определить около 40 наиболее тяжелых наследственных болезней. Молекулярная диагностика генов наследственных болезней проводится в НИИ акушерства и гинекологии в Санкт-Петербурге, в Научном центре медицинской генетики и Институте неврологии РАМН в Москве, в Институте биохимии и генетики научного центра РАН в Уфе, в Институте медицинской генетики в Томске и в Медико-генетическом центре в Новосибирске.
Методы молекулярной диагностики позволяют выявить не только гены наследственных болезней, но и гены предрасположенности к тому или иному заболеванию. Среди болезней, вызванных наличием в геноме генов предрасположенности, различают заболевания "с поздним началом" и мультифакториальные болезни. Заболевания с "поздним началом" (например, рак молочной железы, хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера, семейный полипозный рак толстого кишечника, ряд нейродегенеративных заболеваний) генетически могут быть обнаружены уже при рождении ребенка, однако видимые симптомы развиваются в более позднем возрасте. Мультифакториальные болезни (например, диабет, гипертония, атеросклероз, некоторые онкологические заболевания) также определяются при рождении, но проявляются только при неблагоприятных внешних факторах.
Молекулярная геномика уже применяется в Европе и Соединенных Штатах для решения разнообразных задач медицины и медицинской генетики. Например, в Великобритании созданы инфомационные центры, и каждый, позвонивший туда, может получить консультацию по любым вопросам, касающимся своей наследственности и генетической предрасположенности к различным заболеваниям. Во Франции создана и используется на практике компьютерная экспертная система Сезам (SESAM - Systeme Expert Specialisee aux Analyses Medicales) для определения склонности человека к различным заболеваниям. Она включает собственно экспертную систему оценки риска возникновения заболевания, основанную на многочисленных лабораторных (иммунологических, биохимических, серологических и генетических) тестах (более 80), программу для обучения врачей основам молекулярной медицины, медицинское консультирование по результатам лабораторных тестов и популярный справочник для населения. Программа прекрасно зарекомендовала себя во Франции, и хочется верить, что российские медики в недалеком будущем тоже смогут ее использовать.В перспективе это означает рождение генетически здорового потомства, значительное удлинение средней продолжительности жизни, здоровую старость. (В.БАРАНОВ,2001).
В настоящее время создана научная и материально-техническая база для широкого внедрения в клиническую лабораторную диагностику новой генодиагностической технологии - количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов - ПЦР. В ближайшие годы данная технология будет применяться в гепатологии (вирусные гепатиты В и С), в клинике ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций (в первую очередь герпетическая и цитомегаловирусная инфекции), в дерматовенерологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, пульмонологии.
Широкое внедрение в область практического здравоохранения полимеразной цепной реакции (ПЦР) обусловлено простотой ее выполнения, низкой себестоимостью и надежностью. Количественное определение ДНК инфекционных агентов в ходе лечения позволяет получать информацию о правильности или безрезультатности проводимой терапии, помогает предсказывать периоды обострения заболевания и принимать адекватные меры для скорейшего излечения больного без нанесения ущерба для его здоровья, связанного с неэффективной терапией.
На сегодня наиболее перспективным представляется метод ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) (Higuchi R. 1993.).
Сущность метода заключается в исследовании накопления продуктов амплификации с помощью специального прибора без последующего электрофореза. Так как кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её количество (Heid C.A. 1996.).
Отличительными чертами данного метода, в отличие от классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдельном помещении для детекции продуктов реакции.
Данная методика в течение последних пяти лет успешно применяется в крупнейших диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира и в ближайшее время станет так же широко распространена, как и ПЦР в ее сегодняшнем формате, благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК.
Использование математических методов анализа позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. (Екимов А.Н., 2001).
Наиболее рационально и эффективно применение метода полимеразной цепной реакции для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях, внутриклеточных паразитов, персистирующих форм микроорганизмов, атипичных форм бактерий. Обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в клинических образцах является одним из основных диагностических подходов во фтизиатрии.
За последние годы в зарубежной печати появились работы, характеризующие ПЦР как метод, обладающий высокой чувствительностью, специфичностью и быстротой (в течение 4–5 часов) выявления микобактерий туберкулезного комплекса. Эти преимущества позволяют диагносцировать возбудителя на ранних стадиях заболевания и в различных биологических материалах [Kox L.F.F., 1994; Lassence A.,1992; Skarlatos S.I., 2001.)
Внедрение молекулярно-биологических методов уже сейчас позволяет выявлять резистентность к химиопрепаратам и проводить типирование микобактерий туберкулеза в достаточно короткие сроки. (Бочкарёв Е.Г.и др., 2000).
Таблица 1. Сравнительная чувствительность и продолжительность исполнения различных лабораторных методов выявления микобактерий туберкулезного комплекса
Метод
Чувствительность
Продолжительность исследования
Микроскопия с окрашиванием по Цилю-Нильсену
100.000 - 1.000.000 МБТ в 1 мл
1 – 2 часа
Люминесцентная микроскопия
10.000-100.000 МБТ в 1 мл
1- 2 часа
Культуральный посев
20-100 МБТ в 1 мл
1- 2 месяца
ПЦР
1-10 МБТ в 1 мл
5 часов

Метод ПЦР основан на ферментативной амплификации выбранных специфических участков генома бактерий рода Mycobacterium tuberculosis(M. bovis, M. africanum, M. Microti), их дальнейшей детекции и идентификации. Аналитическая чувствительность метода, определяемая при последовательных разведениях суспензии бактериальных клеток, очень высока и составляет от 1пг до 5фг микобактериальной ДНК, что эквивалентно выявлению 1-10 бактериальных клеток.
Возрастающее число мультирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis представляет собой серьезную проблему для современного здравоохранения. Лечение пациентов, инфицированных мультирезистентными штаммами, требует применения более токсичных и дорогостоящих химиопрепаратов, длительной госпитализации и, тем не менее, часто остается неэффективным, обуславливая высокий удельный вес инвалидизации и смертности.
Основным в решении этой проблемы является своевременная детекция мультирезистентных штаммов на ранних стадиях заболевания, которая позволит контролировать дальнейшее распространение конкретного выявленного штамма и подобрать оптимальную схему химиотерапии. Тем не менее, определение спектра лекарственной резистентности классическими методами на селекционных средах занимает от 3-х недель до 3-х месяцев, что делает полученный результат ретроспективным.
Альтернативным и более перспективным вариантом решения этой проблемы является использование генотипических методов анализа, основанных на выявлении точечных мутаций или других генетических детерминант, обеспечивающих резистентность к антибиотикам. Этот подход стал возможным благодаря определенному успеху в исследовании молекулярных основ резистентности Mycobacterium tuberculosis к таким противотуберкулезным препаратам, как рифампицин [Telenti A.,1993.), изониазид (Sherman DR, 1996.), фторхинолоны (Takiff H. E, et al., 1994), стрептомицин (Heym B., 1994.) и канамицин (Suzuki Y., 1998.). Его отличительной чертой является небольшой срок выполнения анализа, составляющий 2-3 дня.
Рифампицин является одним из основных туберкулостатиков, что обуславливает высокий удельный вес резистентных к нему штаммов. Актуальность выявления резистентности к рифампицину обусловлена тем, что до 80 - 90% рифампицин-резистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis устойчивы и к изониазиду, что позволяет считать рифампицин-резистентные штаммы своеобразным косвенным "маркером" мультирезистентности (Heym B.et.al., 1994).
Около 95% резистентных к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis содержат точечные мутации, делеции или вставки в гене rpoB, кодирующем b - субъединицу РНК-полимеразы. Современные методы генодиагностики резистентности к рифампицину основаны на детекции мутаций, большая часть которых компактно локализована в высоко консервативной области rpoB гена (Telenti A. Et.al., 1993).
Следует отметить, что эффективность такого подхода для детекции резистентных штаммов во многом зависит от того, насколько полно исследованы и охарактеризованы ассоциированные с резистентностью мутации. Считается, что тип и частота встречаемости определенных мутаций в rpoB гене достаточно консервативны среди микобактериальных штаммов, распространенных в различных географических районах. В то же время, в ряде исследований была отмечена и определенная географическая вариабельность таких мутаций (Rinder H.et.al. , 1997). К сожалению, штаммы, выявляемые на территории Российской Федерации и стран СНГ, в этом отношении остаются пока малоисследованными.
В целом, с учетом изложенного, прямое секвенирование ПЦР фрагментов rpoB гена выглядит наиболее универсальным генотипическим методом детекции резистентности к рифампицину. Наибольшая информативность такого подхода позволяет максимально полно охарактеризовать весь спектр возможных мутаций и правильно оценить резистентность исследуемых штаммов, а в ряде случаев и их эпидемиологические особенности. Немаловажно, что при большей информативности по сравнению с другими методами себестоимость одного анализа путем прямого секвенирования ниже, чем при использовании набора INNO-LiPA Rif.TB и составляет $3. С технической точки зрения, анализы такого типа можно проводить в специально оборудованных лабораториях противотуберкулезных диспансеров республиканского, краевого и областного подчинения.
Как диагностический прием прямое секвенирование применимо и для выявления резистентности Mycobacterium tuberculosis к другим противотуберкулезным препаратам. Внедрение молекулярно-биологических методов диагностики, основанных на применении полимеразной цепной реакции, значительно повышает эффективность выявления микобактерий туберкулезного комплекса по сравнению с традиционными микробиологическими методами (бактериоскопия, люминесцентная микроскопия, посев). При туберкулезе органов дыхания преимущество ПЦР наиболее ощутимо при недеструктивных и ограниченных формах болезни. При внелегочных формах болезни, характеризующихся олигобациллярностью, более адекватной диагностике будут способствовать использование различных способов выделения ДНК, одновременное исследование различных по характеру биологических образцов от одного больного и применение туберкулино-провокационных проб.
Сочетание молекулярных методов типирования микобактерий туберкулеза с методами прямой детекции (секвенирование) резистентности к химиопрепаратам позволит в дальнейшем проводить не только статистические мониторинговые эпидемиологические исследования, но и получать достоверные результаты в клинически значимом масштабе времени. (Бочкарёв Е.Г. и др., 2000). (Более подробно см. Skarlatos S.I.,Vellerti P.A., Morris M., Davies P. NEW VISTAS IN THERAPEUTICS: FROM DRUG DESIGN TO GENE THERAPY.
Annals of the New York Academy of Sciences.V.953,dec. 2001.)
Использование гибридизационных технологий открывает новые перспективы генодиагностики вирусных гепатитов В и С. Количественные методики оценки вируса, основанные на детекции продуктов ПЦР реакции путем гибридизации с внутреннем зондом, станут более простыми и общедоступными. Для детекции генетических изменений, встречающихся в популяции вирусов В и С (НВе негативные мутанты ВГВ и генотипы ВГС) возможно использование принципа обратной гибридизации с типоспецифичным зондом. Реализация этих возможностей позволит создать первые отечественные тест-системы для типирования вирусов В и С.(Ильина Е.Н. и др.2000).
Благодаря методу ПЦР, стало возможным выявлять не только ДНК вируса гепатита В, но и определять фрагменты генома вируса, в которых произошла мутация. Так, например, оказалось что НBe – негативный хронический гепатит В (при котором не выявляется HBe Ag) – это мутант вируса гепатита В, у которого мутация произошла в области кодирующей HBeAg (precore мутантный вариант), и инфекция этим вариантом вируса имеет свою клиническую картину. HBe негативный хронический гепатит В имеет больший циррозогенный потенциал и менее эффективно лечится. Открытие мутаций в зоне кодирующей HBsAg, показало, что современная вакцина не сможет предупредить инфекцию этим вариантом вируса (HBV “S” вариант). У небольшого процента больных хроническим гепатитом В вообще не выявляется HBsAg, что, возможно, тоже связано с мутационным процессом, и арбитражным методом диагностики в данном случае является выявление ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови. Молекулярно-биологические методы изучения мутационного процесса позволили показать, что возможно как первичное заражение мутантным вариантом вируса гепатита В, так и инфицирование “диким” вариантом с последующей мутацией его в процессе длительной персистенции вируса в организме человека.
С момента внедрения этого метода в клиническую практику прошло не многим более 5 лет, а диагностические возможности этого метода продолжают расширяться и позволяют нам лучше понять патогенез заболевания и разрабатывать новые методы лечения.

РНК-ПЦР пока является единственным высокочувствительным методом диагностики острого гепатита С и обнаружения больных серонегативным хроническим гепатитом С. РНК-ПЦР дает возможность провести генотипирование ВГС и количественную оценку уровня виремии, что позволяет выбрать наиболее благоприятный момент для начала противовирусной терапии и прогнозировать ее исход. С помощью РНК-ПЦР можно обнаружить репликацию ВГС, установить этиологическую и патогенетическую роль ВГС в различных внепеченочных синдромах. Упрощение, стандартизация и, возможно, автоматизация этого метода позволят использовать его при исследовании донорской крови и трансплантируемых органов.
Метод ПЦР используется для постановки и/или подтверждения диагноза, контроля терапии в акушерско-гинекологической практике, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, гепатологии, пульмонологии, офтальмологии, неврологии, фтизиатрии и др.

<< Предыдущая

стр. 5
(из 7 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>