стр. 1
(из 4 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>

А.Н.Евтушенков , Ю.К.Фомичев



ВВЕДЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЮ


Курс лекций

























Минск БГУ 2002
УДК 577.4(075.8) ББК




Рецензент кандидат биологических наук, доцент Р.А.. Желдакова



Печатается по решению Редакционно- издательского совета Белорусского государственного университета





Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К.
Введение в биотехнологию: Курс лекций:/ А.Н.Евтушенков, Ю.К.Фомичев. - Мн.:
БГУ, 2002. - 105 с. ISBN . В данном издании изложены основные понятия о биотехнологическом процессе, об особенностях объектов биотехнологии, их культивировании и использовании. Предназначено для студентов биологического факультета по направлению G31 01 01 -03 «Биотехнология».

УДК 577.4(075.8) ББК
А.Н.Евтушенков, Ю.К.Фомичев 2002 © БГУ, 2002
Учебное издание
Евтушенков Анатолий Николаевич Фомичев Юрий Константинович

ВВЕДЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЮ
Курс лекций

Для студентов по направлению G31 01 01 -03 «Биотехнология».
В авторской редакции Ответственный за выпуск А.Н.Евтушенков


Подписано в печать . Формат 60х84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать офсетная. Усл. печ. л. 3,95. Уч.-изд. л. . Тираж 100 экз.
Налоговая льгота - Общегосударственный классификатор Республики Беларусь ОКРБ 007-98, ч. 1; 22.11.20.600. Белорусский государственный университет. Лицензия ЛВ № 315 от 14.07.98. 220050, Минск, пр. Ф. Скорины, 4.
Отпечатано с оригинала-макета заказчика в Республиканском унитарном предприятии «Издательский центр БГУ». Лицензия ЛП № 461 от 14.08.2001. 220030, Минск, ул. Красноармейская,
6.

СОДЕРЖАНИЕ
Предмет и задачи биотехнологии
Выбор биотехнологических объектов
Технология ферментационных процессов
Культивирование биотехнологических объектов
Производство одноклеточного белка
Отделение, очистка и модификация продуктов
Ферментная технология
Клеточная инженерия

1

Предмет и задачи биотехнологии
В настоящий момент вряд ли у кого-нибудь может возникнуть сомнение в том, что современная биология представляет собой наиболее разнообразную область естественных наук. Действительно, она включает казалось бы совершенно не связанные между собой разделы научных знаний: микробиологию, анатомию растений и животных, биохимию, иммунологию, клеточную биологию, физиологию растений и животных, различные систематики, экологию, генетику, биофизику, математику и много других областей естествознания.
Постоянно увеличивающееся разнообразие современной биологии началось после окончания второй мировой войны, когда в биологию внедрились другие естественнонаучные дисциплины, такие как физика, химия и математика, которые сделали возможным описание жизненных процессов на новом качественном уровне - на уровне клетки и молекулярных взаимодействий.
Именно существенные успехи в фундаментальных исследованиях в области биохимии, молекулярной генетики и молекулярной биологии, достигнутые во второй половине текущего столетия, создали реальные предпосылки управления различными (пусть, возможно и не самыми главными) механизмами жизнедеятельности клетки. Сложившаяся благоприятная ситуация в биологии явилась мощным толчком в развитии современной биотехнологии, весьма важной области практического приложения результатов фундаментальных наук. Можно с уверенностью утверждать, что биотехнология является наиболее разительным примером того, как результаты, казалось бы "чистой науки", находят применение в практической деятельности человека. Основой, обеспечивающей благоприятную ситуацию для бурного развития биотехнологии, явились революционизирующие открытия и разработки:
доказательства роли нуклеиновых кислот в хранении и передаче наследственной информации в биологических системах (имеются в виду индивидуальные клетки и отдельные организмы, а не их популяции);
расшифровка универсального для всех живых организмов генетического кода;
раскрытие механизмов регуляции функционирования генов в процессе жизни одного поколения организмов;

совершенствование существовавших и разработка новых технологий культивирования микроорганизмов, клеток растений и животных;
как логическое следствие из вышесказанного, явилось создание (возникновение) и бурное развитие методов генетической и клеточной инженерии, с помощью которых искусственно создаются новые высокопродуктивные формы организмов, пригодные для использования в промышленных масштабах.
Абсолютно новым направлением является так называемая инженерная энзимология, возникшая вследствие развития современных методов изучения структуры и синтеза белков-ферментов и выяснения механизмов функционирования и регуляции активности этих соединений (важных элементов клетки). Достижения в этой области позволяют направленно модифицировать белки различной сложности и специфичности функционирования, разрабатывать создание мощных катализаторов промышленно ценных реакций с помощью высоко стабилизированных иммобилизованных ферментов.
Все эти достижения вывели биотехнологию на новый уровень ее развития, позволяющий сознательно и целенаправленно управлять сложными клеточными процессами. Данная новая область биологических знаний и ее последние достижения уже стали крайне важными для здоровья и благополучия человека.
И все же, что ожидает биотехнологию, в случае реализации всех надежд, которые на нее возлагаются? И наконец, что же такое биотехнология и каковы ее направления деятельности?
Термин «биотехнология» был введен в 1917 г. венгерским инженером Карлом Эреки при описании процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению Эреки, биотехнология — это «все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты». Приведенная на рис. 1 схема иллюстрирует биотехнологический процесс.

Исходная обработка





Ферментация и биотрансформация






Конечная обработка





Продукт

Рис. 1. Основные этапы биотехнологического процесса. Термин был введен Карлом Эреки и относился к крупномасштабному получению свинины (конечный продукт) с использованием дешевой сахарной свеклы (сырье) в качестве корма для свиней (биотрансформация)
Однако этот термин в те годы не получил широкого распространения. Только в 1961 г. к нему вновь вернулись после того как шведский микробиолог Карл Герен Хеден порекомендовал изменить название научного журнала "Journal of Microbiological and Biochemical Engineering and Technology" (Журнал микробиологической и химической инженерии и технологии), специализирующегося на публикации работ по прикладной микробиологии и промышленной ферментации, на "Biotechnology and Bioengineering" (Биотехнология и биоинженерия). С этого момента биотехнология оказалась четко и необратимо связана с исследованиями в области «промышленного производства товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов».
Понятие биотехнология может быть представлено многими определениями:
использование биологических объектов, систем или процессов для производства необходимых продуктов или для нужд сервисной индустрии;
комплексное применение биохимических, микробиологических и инженерных знаний с целью промышленного использования потенциальных возможностей микроорганизмов, культур клеток и отдельных их компонентов или систем;
технологическое использование биологических явлений для воспроизводства и получения (изготовления) различных типов полезных продуктов;
приложение научных и инженерных принципов для обработки материалов биологическими агентами с целью получения необходимых продуктов или создания сервисных технологий. Биотехнология на самом деле не что иное, как название, данное
набору технических приемов (подходов) и процессов, основанных на использовании для этих целей биологических объектов.
Термин биотехнология включает составляющие «биос», «техне», «логос» греческого происхождения (от греч. «биос» - жизнь, «техне» -искусство, мастерство, умение и «логос» - понятие, учение).
Таким образом, как это явствует из приведенных определений, биотехнология по существу сводится к использованию микроорганизмов, животных и растительных клеток или же их ферментов для синтеза, разрушения или трансформации (превращения) различных материалов с целью получения полезных продуктов для различных нужд человека.
Биотехнологические направления имеют своей целью создание и практическое внедрение (т. е. практическое использование):
новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов, используемых в здравоохранении для диагностики, профилактики и лечения различных заболеваний;
биологических средств защиты сельскохозяйственных растений от возбудителей заболеваний и вредителей, бактериальных удобрений и регуляторов роста растений и животных; новых сортов растений, устойчивых к разного рода неблагоприятным воздействиям (факторам внешней среды); новых пород животных с полезными свойствами (трансгенные животные);
ценных кормовых добавок для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных (кормового белка, аминокислот, витаминов, ферментов, способствующих повышению усвояемости кормов, и т. п.);
новых биоинженерных методов для получения высокоэффективных препаратов различного назначения, используемых в сельском хозяйстве и ветеринарии;
новых технологий создания и получения хозяйственно ценных продуктов для пищевой, химической и микробиологической промышленности;
эффективных технологий переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов для получения продуктов, которые могут использоваться в других отраслях хозяйственной деятельности человека (например, биогаза, удобрений, топлива для автомобилей и т. п.).
Само собой разумеется, что такие комплексные задачи требуют интеграции различных отраслей научных и технических знаний и характеризуют биотехнологию как ряд перспективных технологий, которые найдут применение в самых разнообразных индустриальных направлениях. Интеграция биологии, химии и инженерных приемов в биотехнологии осуществляется таким путем, чтобы обеспечить максимальное использование потенциальных возможностей всех входящих в нее областей знаний. И все же, несмотря на комплексность биотехнологии, ее нельзя рассматривать как нечто единое целое, наподобие микроэлектроники. Скорее она должна рассматриваться как ряд перспективных технологий, сочетания которых будут постоянно варьировать в зависимости от конкретных практических задач.
Биотехнология - междисциплинарная область научно-технического прогресса, возникшая на стыке биологических, химических и технических знаний и призванная к созданию новых биотехнологических процессов, которые в большинстве случаев будут осуществляться при низких температурах, требовать небольшого (меньшего) количества энергии и будут базироваться преимущественно на дешевых субстратах, используемых в качестве первичного сырья.
Однако следует отдавать себе отчет в том, что биотехнология не является чем-то новым, ранее не известным, а представляет собой развитие и расширение набора технологических приемов, корни которых появились тысячи лет тому назад.
Биотехнология включает многие традиционные процессы, давно известные и давно используемые человеком. Это пивоварение, хлебопечение, изготовление вина, производство сыра, приготовление многих восточных пряных соусов, а также разнообразные способы утилизации отходов. Во всех перечисленных процессах использовались биологические объекты (пусть даже без достаточных знаний о них) и все эти процессы на протяжении многих лет совершенствовались, правда эмпирически. Начало этого этапа биотехнологии теряется в глубине веков и он продолжался примерно до конца XIX в.
Работы великого французского ученого Луи Пастера (1822-1895) заложили фундамент практического использования достижений микробиологии и биохимии в традиционных биотехнологиях (пивоварение, виноделие, производство уксуса) и ознаменовали начало нового, научного периода развития биотехнологии. Для этого периода характерно развитие промышленной биотехнологии, в особенности ферментационных процессов в промышленных масштабах. Были разработаны стерильные процессы производства путем ферментации ацетона, глицерина. Интенсивно изучаются основные группы микроорганизмов - возбудителей процессов брожения, исследуются биохимические особенности данных процессов. После открытия Александром Флемингом пенициллина разрабатываются процессы и аппараты для глубинного культивирования продуцентов, что резко удешевило производство данного антибиотика, и он стал доступным для широкого использования в клинической практике во время второй мировой войны.
После войны быстрыми темпами развивались процессы ферментации для производства антибиотиков, стероидных гормонов, а в 1961 г. возник журнал «Биотехнология и биоинженерия» и снова термин «биотехнология» стал применяться для обозначения процессов, которые относили к области промышленной микробиологии.
Однако термин «биотехнология» в большей степени стал ассоциироваться с новым этапом развития этой науки, начало которому положено в 1973 г., когда Стэнли Коэн и Герберт Бойер получили рекомбинантные плазмиды и произвели трансформацию ими клеток E.coli. В течение четырех лет после открытия рекомбинантных ДНК-технологий появились штаммы бактерий, продуцирующие инсулин и человеческий гормон роста. Это привело к притоку инвестиций в новые компании. В настоящее время в США только микробная (основанная на культивировании генетически модифицированных микроорганизмов) биотехнология представлена 1300 компаниями, насчитывающими 153 000 служащих, с годовым доходом 19,6 млрд долл. и с продажами 13,4 млрд долл. В Канаде 282 компании с годовым доходом 1,1 млрд долл., В Японии с годовым доходом 10,0 млрд долл., в Европе 1178 компаний (45 000 служащих) с годовым доходом 3,7 млрд долл. Основные продукты, получаемые с помощью микроорганизмов и рекомбинантных ДНК-технологий - животные пептиды, такие как гормоны, факторы роста, ферменты, антитела и биологические модификаторы иммунного ответа.
По приблизительной оценке, общемировая рыночная стоимость растениеводческой продукции, полученной на основании ДНК-технологий, достигнет к 2010 г. 30-40 млрд. долларов. Мировой рынок биотехнологической продукции составляет ежегодно около 150 млрд. долл.
Во многих странах мира приняты национальные программы по биотехнологии. Так, например, в США ежегодные затраты на биотехнологию составляют 2-3 млрд. долл. В Германии на 2001 год выделено около 2 млрд. марок на новую программу по биотехнологии. В табл. 1 приведены основные факты, характеризующие развитие биотехнологии.
Вполне обоснованно предполагать, что скорость практического использования биотехнологических достижений в меньшей степени будет определяться научными и техническими условиями, а больше будет зависеть от таких факторов, как капиталовложения заинтересованных отраслей промышленности, улучшение технологических схем, рыночных ситуаций и экономичности новых методов по сравнению с недавно внедренными технологиями иного типа.
Отрасли промышленности, с которыми будет конкурировать биотехнология, включают изготовление пищи для людей и животных, создание и производство новых материалов, призванных заменить изготовляемые с помощью нефтехимии, создание альтернативных источников энергии, разработку технологии безотходных производств, контроль и устранение загрязнений и сельское хозяйство. Конечно, биотехнология революционизирует и многие разделы медицины, ветеринарии и фармацевтической промышленности.
Вышеизложенное однозначно предполагает рассмотрение биотехнологии как межотраслевой дисциплины, основанной на применении многопрофильной стратегии (различных подходов) для решения различных проблем.
Таблица 1
1944
Эвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что генетический материал представлен ДНК
1953
Уотсон и Крик определили структуру молекулы ДНК
1961
Учрежден журнал "Biotechnology and Bioengineering"
1961­1966
Расшифрован генетический код
1970
Выделена первая рестрицирующая эндонуклеаза
1972
Корана и др. синтезировали полноразмерный ген тРНК
1973
Бойер и Коэн положили начало технологии рекомбинантных ДНК
1975
Колер и Мильштейн описали получение моноклональных антител
1976
Изданы первые руководства, регламентирующие работы с рекомбинантными ДНК
1976
Разработаны методы определения нуклеотидной последовательности
ДНК
1978
Фирма Genentech выпустила человеческий инсулин, полученный с помощью E. coli
1982
Разрешена к применению в Европе первая вакцина для животных, полученная по технологии рекомбинантных ДНК
1983
Для трансформации растений применены гибридные Ti-плазмиды
1988
Создан метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
1990
В США утвержден план испытаний генной терапии с использованием соматических клеток человека
1990
Официально начаты работы над проектом «Геном человека»
1994­1995
Опубликованы подробные генетические и физические карты хромосом человека
1996
Ежегодный объем продаж первого рекомбинантного белка (эритропоэтина) превысил 1 млрд. долларов
1997
Клонировано млекопитающее из дифференцированной соматической клетки
Биотехнология применяет методы, заимствованные из химии, микробиологии, биохимии, молекулярной биологии, химической технологии и компьютерной техники с целью создания новых разработок, развития и оптимального использования процессов, в которых каталитические реакции играют фундаментальную и незаменимую роль. Любой биотехнолог должен стремиться к достижению тесного кооперирования со специалистами других смежных (близких) дисциплин, таких, как медицина, пищевая промышленность, фармацевтика и химическая индустрия, защита окружающей среды и процессы переработки продуктов, представляющих собой отходы различных производств.
Главная причина успехов биотехнологии кроется в разительных успехах и быстром прогрессе молекулярной биологии, в частности в разработке технологии рекомбинантных молекул ДНК. С помощью этой технологии оказалось возможным непосредственно манипулировать с наследственным материалом клеток, получая новые сочетания полезных признаков и способностей. Возможности этих технических приемов, которые впервые были разработаны в лабораториях, вскоре оказались вполне приемлемыми в промышленных условиях. Однако, несмотря на определенные, а порой и весьма значительные выгоды, которые несет технология рекомбинантных молекул, постоянно следует учитывать возможные опасности, связанные с вмешательством человека в природу. В настоящее время развитие биотехнологии осуществляется со скоростью, напоминающей таковую при становлении микроэлектронной промышленности в середине 70-х годов.
Ни для кого уже не является секретом, что ископаемое топливо (хотя и добываемое в настоящее время с большим избытком), а также другие не восполняемые ресурсы, в один прекрасный день станут крайне ограниченными. И совершенно естественно, что данное обстоятельство уже сейчас заставляет искать новые, более дешевые и лучше сохраняемые источники энергии и питания, которые могли бы восполняться биотехнологическим путем. В этой ситуации страны с климатом, позволяющим ежегодно производить большие количества биомассы, будут находиться в более выгодных условиях по сравнению со странами с менее благоприятными климатическими условиями. В частности, тропические области земного шара в этом отношении имеют существенное преимущество над другими регионами.
Следующим фактором, способствующим росту интереса к биотехнологии, является современный мировой спад в химических и инженерных направлениях, обусловленный частичным истощением источников энергии. В силу этого биотехнология рассматривается в качестве одного из важнейших средств рестимуляции (обновления) экономики на основе новых методов, новой технологии и новых сырьевых материалов. Фактически, индустриальный бум 1950-х и 1960-х годов был обусловлен дешевой нефтью, так же как успехи в информационной технологии обусловили в 1970-х и 1980-х годах развитие микроэлектроники. И есть основания полагать, что 2000-е годы станут эрой биотехнологии. Во всяком случае, в мире отмечается существенный подъем исследований в области молекулярной биологии, возникновение новых биотехнологических компаний, увеличение инвестиций в биотехнологические отрасли промышленности (как национальными компаниями, так и отдельными лицами), а также рост фундаментальных знаний, увеличение количества источников информации и средств информатики.
Многие биотехнологические процессы могут рассматриваться как имеющие три главных стержневых компонента: первая часть состоит в получении наиболее оптимальных катализаторов специфических процессов, вторая часть сводится к обеспечению по возможности оптимальных условий для осуществления требуемого каталитического процесса и третья - связана с отделением и очисткой целевого продукта или продуктов из ферментационной смеси.
В большинстве случаев наиболее эффективной, стабильной и удобной формой для катализа биотехнологических процессов являются цельные организмы, вследствие чего в биотехнологии широко используются микробиологические процессы. Конечно, это не исключает использование и высших организмов (в частности, культур растительных и животных клеток), которые, несомненно, в будущем будут играть важную роль в биотехнологии.
Микроорганизмы обладают огромным генетическим пулом (фондом), позволяющим им осуществлять практически неограниченную биосинтетическую деятельность и потенциал деградации. Кроме того, микроорганизмам присущ исключительно быстрый рост, скорость которого намного превышает скорость роста высших организмов (растений и животных). Указанное свойство позволяет за короткий промежуток времени осуществить синтез больших количеств требуемого продукта в строго контролируемых условиях.
Существенным моментом первого компонента биотехнологии является селекция и улучшение объекта с помощью различных генетических методов, а в последнее время с использованием высокоэффективных приемов молекулярной биологии, которые, как уже упоминалось, способны обеспечить конструирование организмов с новыми биохимическими возможностями.
Во многих случаях катализатор используется в изолированной форме в виде очищенного фермента, для получения которого в настоящее время разработаны эффективные методы выделения и очистки, а также методы стабилизации.
Второй компонент биотехнологии связан с изготовлением систем, обеспечивающих оптимальное функционирование организмов-продуцентов или чистых ферментов. Сюда относятся специальные знания о химии процессов, а также сведения об инженерном обеспечении конструирования и изготовления этих систем.

Наконец, третий компонент представляет собой довольно сложную и дорогую процедуру биотехнологического процесса - выделение и очистку целевого продукта. Этот компонент существенно увеличивает стоимость всего процесса и может составлять до 70% стоимости готового коммерческого препарата.
Многоэтапность биотехнологических процессов определяет необходимость привлечения к их осуществлению специалистов самого различного профиля: генетиков и молекулярных биологов, биохимиков, вирусологов, микробиологов и клеточных физиологов, инженеров-технологов, конструкторов биотехнологического оборудования и т. п. Сказанное позволяет утверждать, что чистых специалистов-биотехнологов в природе не существует, да такого специалиста нельзя себе и представить. Поэтому в биотехнологии с равным успехом работают и микробиологи, и генетики, и биохимики, и клеточные и генетические инженеры, и конструкторы, и т. д. и т. п., от деятельности которых зависит пpoгpeсс и успех данной отрасли. Однако необходимо отдавать себе отчет в том, что на развитие биотехнологии существенное влияние могут оказывать деятельность различных политических и экономических сил.

2
Выбор биотехнологических объектов
Главным звеном биотехнологического процесса, определяющим всю его сущность, является биологический объект, способный осуществлять определенную модификацию исходного сырья и образовывать тот или иной необходимый продукт. В качестве таких объектов биотехнологии могут выступать клетки микроорганизмов, животных и растений, трансгенные животные и растения, а также многокомпонентные ферментные системы клеток и отдельные ферменты.
Основой большинства современных биотехнологических производств до сих пор все еще является микробный синтез, т. е. синтез разнообразных биологически активных веществ с помощью микроорганизмов. К сожалению, объекты растительного и животного происхождения в силу ряда причин еще не нашли столь широкого применения.
Независимо от природы объекта, первичным этапом разработки любого биотехнологического процесса является получение чистых культур организмов (если это микробы), клеток или тканей (если это более сложные организмы - растения или животные). Многие этапы дальнейших манипуляций с последними (т.е. с клетками растений или животных), по сути дела, являются принципами и методами, используемыми в микробиологических производствах. И культуры микробных клеток, и культуры тканей растений и животных с методической точки зрения практически не отличаются от культур микроорганизмов. Поэтому дальнейшие рассуждения целесообразно вести применительно к микробиологическим объектам.
Мир микроорганизмов крайне разнообразен. В настоящее время относительно хорошо охарактеризовано (или известно) более 100 тысяч различных их видов. Это в первую очередь прокариоты (бактерии, актиномицеты, риккетсии, цианобактерии) и часть эукариот (дрожжи, нитчатые грибы, некоторые простейшие и водоросли). При столь большом разнообразии микроорганизмов весьма важной, а зачастую и сложной, проблемой является правильный выбор именно того организма, который способен обеспечить получение требуемого продукта, т. е. служить промышленным целям. Разделение микроорганизмов на промышленные и непромышленные для лиц, далеких от микробиологии, молекулярной биологии и молекулярной генетики, кажется достаточно определенным: те микроорганизмы, которые используются в промышленном производстве - промышленные, а те, которые не используются, -непромышленные.
Однако для тех, кто близко соприкасается с вышеперечисленными отраслями биологических знаний, граница проходит между немногочисленной, но глубоко изученной группой микроорганизмов, служащих модельными объектами при исследованиях фундаментальных жизненных процессов, и всеми остальными микроорганизмами, которые, как правило, генетиками, молекулярными биологами и генными инженерами не изучались совсем или изучались в очень ограниченной степени. К числу первых относятся кишечная палочка (E. coli), сенная палочка (Bac. subtilis) и пекарские дрожжи (S. cerevisiae).
Во многих биотехнологических процессах используется ограниченное число микроорганизмов, которые классифицируются как GRAS («generally recognized as safe» обычно считаются безопасными). К таким микроорганизмам относят бактерии Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, другие виды бацилл и лактобацилл, виды Streptomyces. Сюда также относят виды грибов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus и дрожжей Saccharomyces и др. GRAS-микроорганизмы непатогенные, нетоксичные и в основном не образуют антибиотики, поэтому при разработке нового биотехнологического процесса следует ориентироваться на данные микроорганизмы, как базовые объекты биотехнологии.
Микробиологическая промышленность сегодня использует тысячи штаммов из сотен видов микроорганизмов, которые первично были выделены из природных источников на основании их полезных свойств, а затем (в большинстве своем) улучшены с помощью различных методов. В связи с расширением производства и ассортимента выпускаемой продукции в микробиологическую промышленность вовлекаются все новые и новые представители мира микробов. Следует отдавать себе отчет, что в обозримом будущем ни один из них не будет изучен в той же степени, как E.coli и Bac.subtilis. И причина этого очень простая -колоссальная трудоемкость и высокая стоимость подобного рода исследований.
Следовательно, возникает проблема разработки стратегии и тактики исследований, которые обусловили бы с разумной затратой труда извлечь из потенциала новых микроорганизмов все наиболее ценное при создании промышленно важных штаммов-продуцентов, пригодных к использованию в биотехнологических процессах.
Классический подход заключается в выделении нужного микроорганизма из природных условий.
Из естественных мест обитания предполагаемого продуцента отбирают образцы материала (берут пробы материала) и производят посев в элективную среду, обеспечивающую преимущественное развитие интересующего микроорганизма, т. е. получают так называемые накопительные культуры.
Следующим этапом является выделение чистой культуры с
дальнейшим дифференциально-диагностическим изучением
изолированного микроорганизма и, в случае необходимости, ориентировочным определением его продукционной способности.
Существует и другой путь подбора микроорганизмов-продуцентов -это выбор нужного вида из имеющихся коллекций хорошо изученных и досконально охарактеризованных микроорганизмов. При этом, естественно, устраняется необходимость выполнения ряда трудоемких операций.
Главным критерием при выборе биотехнологического объекта (в нашем случае микроорганизма-продуцента) является способность синтезировать целевой продукт. Однако помимо этого, в технологии самого процесса могут закладываться дополнительные требования, которые порой бывают очень и очень важными, чтобы не сказать решающими. В общих словах микроорганизмы должны:
обладать высокой скоростью роста;
утилизировать необходимые для их жизнедеятельности дешевые субстраты;
быть резистентными к посторонней микрофлоре, т. е. обладать высокой конкурентоспособностью.
Все вышеперечисленное обеспечивает значительное снижение затрат на производство целевого продукта. Конечно, в каждом конкретном случае ведущим является какой-то один из этих критериев, поскольку в природе устроено так, что во всем получить выигрыш не удается никогда. И это правило необходимо постоянно иметь в виду. Ниже приводятся примеры, имеющие своей целью проиллюстрировать ранее сказанное.
1. Одноклеточные организмы, как правило, характеризуются более высокими скоростями роста и синтетических процессов, чем высшие организмы. Тем не менее это присуще не всем микроорганизмам. Существуют такие из них (например, олиготрофные), которые растут крайне медленно, однако они представляют известный интерес, поскольку способны продуцировать различные очень ценные вещества.
Особое внимание как объекты биотехнологических разработок представляют фотосинтезирующие микроорганизмы, использующие в своей жизнедеятельности энергию солнечного света. Часть из них (цианобактерии и фотосинтезирующие эукариоты) в качестве источника углерода утилизируют СО2, а некоторые представители цианобактерий, ко всему сказанному, обладают способностью усваивать атмосферный азот (т. е. являются крайне неприхотливыми к питательным веществам). Фотосинтезирующие микроорганизмы перспективны как продуценты аммиака, водорода, белка и ряда органических соединений. Однако пpoгpecca в их использовании вследствие ограниченности фундаментальных знаний об их генетической организации и молекулярно-биологических механизмах жизнедеятельности, по всей видимости, следует ожидать не в скором будущем.
Определенное внимание уделяется таким объектам биотехнологии, как термофильные микроорганизмы, растущие при 60-80° С. Это их свойство является практически непреодолимым препятствием для развития посторонней микрофлоры при относительно не стерильном культивировании, т. е. является надежной защитой от загрязнений. Среди термофилов обнаружены продуценты спиртов, аминокислот, ферментов, молекулярного водорода. Кроме того, скорость их роста и метаболическая активность в 1,5-2 раза выше, чем у мезофилов.
Ферменты, синтезируемые термофилами, характеризуются повышенной устойчивостью к нагреванию, некоторым окислителям, детергентам, органическим растворителям и другим неблагоприятным факторам. В то же время они мало активны при обычных температурах. Так, протеазы одного из представителей термофильных микроорганизмов при 200 С в 100 раз менее активны, чем при 75 С. Последнее является очень важным свойством для некоторых промышленных производств. Например, широкое применение в генетической инженерии нашел фермент Taq-полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus.
Ранее уже упоминалось о еще одном весьма существенном свойстве этих организмов, а именно, что при их культивировании температура среды, в которой они пребывают, значительно превышает температуру окружающей среды. Данный высокий перепад температур обеспечивает быстрый и эффективный обмен тепла, что позволяет использовать биологические реакторы без громоздких охлаждающих устройств. А последнее, в свою очередь, облегчает перемешивание, аэрацию, пеногашение, что в совокупности значительно удешевляет процесс.
Селекция. Неотъемлемым компонентом в процессе создания наиболее ценных и активных продуцентов, т. е, при подборе объектов в биотехнологии, является их селекция. А генеральным путем селекции является сознательное конструирование геномов на каждом этапе отбора нужного продуцента. Такая ситуация не всегда могла быть реализована, вследствие отсутствия эффективных методов изменения геномов селектируемых организмов. В развитии микробных технологий в свое время сыграли (да и сейчас еще продолжают играть!) очень важную роль методы, базирующиеся на селекции спонтанно возникающих измененных вариантов, характеризующихся нужными полезными признаками. При таких методах обычно используется ступенчатая селекция: на каждом этапе отбора из популяции микроорганизмов отбираются наиболее активные варианты (спонтанные мутанты), из которых на следующем этапе отбирают новые, более эффективные штаммы. И так далее. Несмотря на явную ограниченность данного метода (приема), заключающуюся в низкой частоте возникновения мутантов, возможности его рано считать полностью исчерпанными.
Процесс селекции наиболее эффективных продуцентов значительно ускоряется при использовании метода индуцированного мутагенеза.
В качестве мутагенных воздействий применяются УФ, рентгеновское и гамма-излучения, определенные химические вещества и др. Однако и этот прием также не лишен недостатков, главным из которых является его трудоемкость и отсутствие сведений о характере изменений, поскольку экспериментатор ведет отбор по конечному результату. Например, устойчивость организма к ионам тяжелых металлов может быть связана с подавлением системы поглощения данных катионов бактериальной клеткой, активацией процесса удаления катионов из клетки или перестройкой системы (систем), которая подвергается ингибирующему действию катиона в клетке. Естественно, знание механизмов повышения устойчивости позволит вести направленное воздействие с целью получения конечного результата за более короткое время, а также селектировать варианты, лучше подходящие к конкретным условиям производства.
Таким образом, тенденцией сегодняшнего дня является сознательное конструирование штаммов микроорганизмов с заданными свойствами на основе фундаментальных знаний о
генетической организации и молекулярно-биологических механизмах осуществления основных функций организма. Короче говоря, применение перечисленных подходов в сочетании с приемами классической селекции является сутью современной селекции микроорганизмов-продуцентов.
Селекция микроорганизмов для микробиологической промышленности и создание новых штаммов часто направлены на усиление их продукционной способности, т.е. образование того или иного продукта. Решение этих задач в той или иной степени связано с изменением регуляторных процессов в клетке, поэтому в настоящем разделе имеет смысл несколько задержаться на возобновлении сведений о регуляции биохимической активности бактериальной клетки.
Как известно, изменения скорости биохимических реакций у бактерий может осуществляться по крайней мере двумя путями. Один из них очень быстрый (реализующийся в течение секунд или минут) заключается в изменении каталитической активности индивидуальных молекул фермента. Второй, более медленный (реализуется в течение многих минут), состоит в изменении скоростей синтеза ферментов. В обоих механизмах используется единый принцип управления системами -принцип обратной связи, хотя существуют и более простые механизмы регуляции активности метаболизма клетки.
Самый простой способ регуляции любого метаболического пути основывается на доступности субстрата или наличии фермента. Действительно, снижение количества субстрата (его концентрации в среде) приводит к снижению скорости потока конкретного вещества через данный метаболический путь. С другой стороны, повышение концентрации субстрата приводит к стимулированию метаболического пути. Поэтому, независимо от каких-то иных факторов, наличие (доступность) субстрата следует рассматривать как потенциальный механизм любого метаболического пути. Иногда эффективным средством повышения выхода целевого продукта является увеличение концентрации в клетке какого-либо определенного предшественника.
Аналогичный эффект может быть получен и в результате повышения концентрации ферментов, что достигается, например, амплификацией генов, контролирующих синтез соответствующего фермента. Наиболее распространенным способом регуляции активности метаболических реакций в клетке является регуляция по типу ретроингибирования.
Биосинтез многих первичных метаболитов характеризуется тем, что при повышении концентрации конечного продукта данного биосинтетического пути угнетается активность одного из первых ферментов этого пути.
Впервые о наличии такого регуляторного механизма было сообщено в 1953 г. A. Novik и L. Szillard, исследовавшими биосинтез триптофана клетками E. coli. Заключительный этап биосинтеза данной ароматической аминокислоты состоит из нескольких, катализируемых индивидуальными ферментами стадий.
Указанными авторами было обнаружено, что у одного из мутантов E. coli с нарушенным биосинтезом триптофана добавление данной аминокислоты (являющейся конечным продуктом этого биосинтетического пути) резко тормозит накопление одного из предшественников - индол глицерофосфата в клетках. Уже тогда было высказано предположение, что триптофан ингибирует активность какого-то фермента, катализирующего образование индол глицерофосфата.
Несколько позднее было четко установлено, что таким чувствительным к триптофану ферментом является антранилатсинтетаза, которая катализирует более раннюю реакцию триптофанового пути -образование антранилата из хоризмата и глутамина. Этот факт был экспериментально обоснован в опыте, когда добавление триптофана в клеточные экстракты E. coli, содержащие фермент антранилатсинтетазу и его субстраты (хоризмат и глутамин), приводило к резкому ингибированию образования антранилата. Более того, было однозначно продемонстрировано, что активность антранилатсинтетазы подавляется только триптофаном и никакие другие метаболиты клетки подобного действия не оказывают. Существует мнение, что регуляция по типу ретроингибирования является общим свойством клеточного метаболизма. Более тщательное изучения механизма ингибирования активности фермента метаболитами этого же пути, проведенное в условиях in vitro, показало, что метаболит, являющийся ингибитором, специфически связывается с участком молекулы фермента, обладающим высокой степенью сродства к данному ингибитору и абсолютно отличающимся от активного центра фермента (т. е. не перекрывающимся с каталитическим центром). Этот участок получил название аллостерического центра (от греч. "аллос" - другой, "стерос" - пространственный), а сами ферменты, обладающие подобным центром, стали называться аллостерическими ферментами. Аллостерические ферменты представляют собой олигомеры, состоящие из взаимодействующих между собой нескольких одинаковых или различающихся субъединиц. При взаимодействии фермента с ингибитором конформация его молекулы изменяется, активный центр при этом также претерпевает изменения, приводящие к утрате каталитической способности фермента. При мутационном изменении аллостерического центра (центра взаимодействия с ингибитором) чувствительность к ингибитору утрачивается и фермент сохраняет свою активность, обеспечивая требуемый для синтеза конечного продукта этап биосинтетического пути.
Зная точно механизм регуляции синтеза интересующего продукта, участвует ли в регуляции механизм ретроингибирования, можно пытаться получить более активный продуцент данного соединения. Для отбора таких продуцентов используют структурные аналоги метаболитов, по отношению к которым селектируют резистентные варианты.
Например, 5-метилтриптофан, аналог триптофана, так же как и триптофан, ингибирует активность антранилатсинтетазы, но не заменяет собой триптофан в клеточном метаболизме, т. е. не способен включаться в клеточные белки без потери последними биологической активности. Вследствие этого данный структурный аналог необходимого метаболита задерживает рост бактерий, если он добавлен в питательную среду, Некоторые мутанты, устойчивые к ингибирующему действию 5-метилтриптофана, способны синтезировать значительные количества триптофана и выделять его во внешнюю среду, а антранилатсинтетаза у них оказывается нечувствительной к триптофану, т. е. не подвержена ретроингибированию этой аминокислотой. Такой методический прием часто используется в селекции продуцентов аминокислот, нуклеотидов и витаминов.
Если же необходимо добиться накопления (продукции) какого-нибудь промежуточного продукта биосинтетического пути, то следует получить мутант с блокированным за этим продуктом этапом. Такой мутант будет зависимым от наличия в среде выращивания вещества, являющегося продуктом заблокированного этапа, либо конечного продукта данного биосинтетического пути.
Давно установлено, что из тысяч ферментов, синтезируемых растущими клетками, одни образуются постоянно и независимо от состава питательной среды, в то время как другие появляются лишь тогда, когда в среде присутствует субстрат их действия. Первые называются конститутивными ферментами (это ферменты гликолиза и др.), вторые относятся к адаптивным или индуцибельным ферментам. Так, клетки E. coli, растущие на среде с глюкозой, обладают следовыми количествами ферментов метаболизма лактозы, а также многих других источников углерода, которые способны усваивать клетки данного микроорганизма.
Но если эти же клетки перенести на среду с лактозой, являющейся в данном случае единственным источником углерода и энергии, то уже через 1-2 минуты можно зарегистрировать повышение активности 0-галактозидазы, ключевого фермента в утилизации лактозы. Этот фермент гидролизует лактозу до глюкозы и галактозы. В течение следующего непродолжительного периода (равного 20-180 минутам) активность 0-галактозидазы повышается примерно в 1000 раз по сравнению с исходным уровнем. Иными словами, имеет место выраженная индукция фермента, которая может быть определена следующим образом:
Индукция фермента - это относительное увеличение скорости его синтеза в ответ на появление в среде культивирования определенного химического соединения, называемого индуктором. Часто великолепными индукторами являются неутилизируемые аналоги субстратов. Например, для Р-галактозидазы таким веществом служит изопропил-Р - D-тио-галактопиранозид (ИПТГ) неметаболизируемый аналог лактозы. С другой стороны, не всегда субстрат является индуктором синтеза соответствующего ему фермента. Так, лактоза, прежде чем выступить в роли индуктора, должна сначала превратиться в свой изомер аллолактозу (под действием Р-галактозидазы).
Механизм генетической регуляции процесса индукции ферментов был расшифрован в экспериментах на кишечной палочке при изучении синтеза упоминавшегося фермента утилизации лактозы-Р-галактозидазы.
В 1961 г. F. Jacob и J. Monod на основании результатов генетического и биохимического изучения процесса утилизации лактозы бактериями E.coli К 12 сформулировали концепцию, получившую широкую известность как "модель оперона". В соответствии с этой моделью данная система регуляции состоит из четырех компонентов: структурных генов (детерминирующих структуру ферментов), гена-регулятора, оператора и промотора. Ген-регулятор определяет структуру белка-репрессора, способного связываться с оператором, который, в свою очередь, контролирует функционирование прилежащих к нему структурных генов. Промотор представляет собой область для связывания с ферментом транскрипции - РНК-полимеразой. Если белок-репрессор связан с оператором, то РНК-полимераза не может перемещаться на промотер и синтез информационной РНК не может осуществляться. Результатом является отсутствие синтеза соответствующих ферментов. Первым из подробно изученных оперонов является лактозный оперон кишечной палочки. Авторы концепции предположили, что репрессор является аллостерическим белком, обладающим двумя специфическими центрами, один из которых характеризуется сродством к нуклеотидной последовательности области оператора, а другой - к молекуле индуктора. Взаимодействие индуктора с репрессором снижает сродство последнего (вследствие изменения центра связывания с оператором) к оператору, результатом чего является освобождение оператора. Репрессор lac-оперона выделен в чистом виде и состоит из четырех идентичных субъединиц (общая молекулярная масса равна 150 000 дальтон). Каждая субъединица взаимодействует с одной молекулой индуктора (т. е. требуется четыре молекулы индуктора, чтобы инактивировать репрессор). Репрессор в чистом виде характеризуется исключительно высоким сродством к оператору и эффективно связывается с нуклеотидной последовательностью lac-оператора в условиях in vitro. В присутствии индуктора связывание нарушается. Изложенные результаты выполненных экспериментов являются веским подтверждением гипотезы Jacob и Monod, которая в настоящее время считается полностью доказанной.
Известно, что мутации в последовательностях гена-регулятора или оператора приводят в определенных случаях к нарушению либо образования полноценного репрессора, либо к нарушению его сродства к оператору. И в том, и в другом случае потребность в индукторе для запуска синтеза информационной РНК, а следовательно, и соответствующих ферментов, исчезает. Подобные мутанты (или мутации) называются конститутивными, поскольку синтез ферментов осуществляется постоянно. Получение конститутивных мутантов имеет важное значение в селекции определенных штаммов промышленных микроорганизмов.
Концепция оперона применима и к процессу репрессии ферментов. Отличием от индуцибельных систем в данном случае является наличие в таких оперонах не активного репрессора (апорепрессора), который в одиночку не способен взаимодействовать с оператором, но может активироваться конечным продуктом (корепрессором) с образованием активного репрессора.
Уже отмечалось, что с помощью аналога триптофана (5-метилтринтофана) можно получить устойчивые к ингибирующему действию триптофана мутанты, характеризующиеся повышенной продукцией данной аминокислоты. У некоторых из этих мутантов нарушен процесс ретроингибирования антранилатсинтетазы; у других -координированно дерепрессированы ферменты пути биосинтеза триптофана (т. е. ферменты триптофанового оперона). Генетический анализ показал, что у таких мутантов поврежден ген-регулятор, располагающийся на значительном расстоянии от контролируемых им генов триптофанового оперона. Такие мутанты являются конститутивными вследствие либо полного отсутствия репрессора, либо в результате невозможности последнего активироваться триптофаном.
Таким образом, изменяя регуляцию индуцибельных и репрессибельных оперонов, существует возможность повышать продукционную активность определенных промышленных штаммов-продуцентов. Уместно отметить, что структурные гены одного метаболического пути не всегда объединены в единый оперон (наподобие лактозному), однако это не мешает их регуляции с помощью индукции или репрессии. Так, например, гены E.coli, детерминирующие структуру ферментов, обеспечивающих биосинтез аргинина, располагаются в различных областях хромосомы, но все контролируются одним и тем же геном-регулятором. Такая система образует регулон. Другим показательным примером является SOS-регулон, гены которого детерминируют структуру более десятка различных белков и ферментов, участвующих в репарации повреждений ДНК клетки. Все эти структурные гены регулируются одним репрессором - продуктом гена ЬхА. Опероны и регулоны, контролирующие взаимосвязанные физиологические функции обнаружены у всех генетически изученных видов бактерий.
Очень важным регуляторным элементом любого оперона является область ДНК, именуемая промотором. Этот участок оперона обеспечивает взаимодействие (связывание) с РНК-полимеразой для начала транскрипции (т. е. синтеза молекулы информационной РНК). От особенностей промотора зависит эффективность транскрипции. Мутации в области промотора, изменяя его активность, могут повышать или понижать экспрессию оперона. Данное свойство промоторов также используется в создании более активных продуцентов.
Большие перспективы в селекции продуцентов открывает генетическая инженерия, методы которой позволяют заменять регуляторные области катаболических оперонов на более эффективные промоторы, повышающие продукцию клетками биологически активных веществ и оюбеспечивающие новые возможности контроля активности генов.
Само собой разумеется, что это не единственные способы повышения продуктивности бактерий за счет изменения регуляторных механизмов.
Технология ферментационных процессов
При ферментационной технологии можно использовать цельные живые клетки (микробов, клетки животных и растений) или какие-нибудь клеточные компоненты (например, ферменты) с целью физических или химических преобразований органических веществ. Однако недостаточно получать требуемые изменения веществ, метод должен иметь преимущества перед другими, применяемыми в настоящее время, технологиями производства этих же самых продуктов.
Преимущества производства органических продуктов биотехнологическими способами перед чисто химическими методами достаточно многогранны:
многие сложные органические молекулы, такие, как белки и антибиотики, не могут практически быть синтезированы химическими способами;
биоконверсия обеспечивает значительно больший выход целевого продукта;
биологические системы функционируют при более низких температурах, менее высоких значениях рН (близких к нейтральному) и т. п.;
каталитические биологические реакции намного специфичнее, чем реакции химического катализа;
биологические процессы обеспечивают почти исключительно продукцию чистых изомеров одного типа, а не их смесей, как это часто бывает в реакциях химического синтеза.
Но вместе с тем биологические способы в сравнении с химическими методами обладают рядом явных недостатков:
1. Биологические системы могут легко быть загрязнены посторонней
нежелательной микрофлорой.
Целевой продукт, синтезируемый биологическим способом, присутствует в довольно сложной смеси, что обусловливает необходимость разделения его от примеси ненужных веществ.
Биотехнологические производства требуют больших количеств воды, которую в итоге необходимо удалять, сбрасывая в окружающую среду.

стр. 1
(из 4 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>