<< Предыдущая

стр. 32
(из 45 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>

случаев, где наблюдается рост клеток, последние в конце концов,
претерпевают неспецифическую дегенерацию" [Swim, 1959, р. 145].
"Опыт многочисленных исследователей свидетельствует, что раннее
культивирование клеток обычно следует определенному сценарию.
который для удобства можно разделить на три фазы. В фазе I клетки
быстро пролиферируют после начальной задержки (лага) и обычно
могут без труда выдержать серию пересевов. Фаза II характеризуется
снижением роста до тех пор. пока этот рост обычно не прекращается
вовсе и клетки в конце концов не исчезают в результате неспецифической дегенерации" [Ibid, p. 159]. "Это вначале сопровождается
увеличением числа гранул в цитоплазме клеток; позднее наблюдаются дегенерирующие клетки, и их численность прогрессивно
увеличивается до тех пор, пока дно флаконов не покрывается
плотным слоем клеточного дебриса..." [Haff, Swim, 1956, р. 201]. Был
также сделан важный вывод, что прекращение размножения клеток —
это не методический артефакт, обусловленный такими факторами, как
размер инокулята, токсичная среда или неспособность клеток
пролиферировать на стекле [Swim, Parker, 1957]. Наконец. Свим
отмечает, что "иногда распознается третья стадия — появлением
активно пролиферируюших клеток в культурах, находящихся в фазе
II" [Swim, 1959, р. 159]. "Следует подчеркнуть, что фазы I и II
представляют собой обычную картину, в то время как фаза III —
сравнительно редкое явление" [Ibid, p. 160]. Свим отметил также, что
клетки в фазе III часто отличаются от исходных клеток и по
морфологии, и по ростовым характеристикам.
Таким образом, неограниченная способность клеток животных к
делению оказалась не правилом, а исключением, причем во многих
185

случаях неограниченно делящиеся клетки уже мало напоминают по
морфологии и ростовым характеристикам исходные нормальные
клетки [Swim, 1959]. Казалось бы, этот вывод давал все основания для
пересмотра концепции Карреля и к возрождению интереса к
концепции Вейсманна. Однако, чтобы сделать это и разрушить в
общественном сознании устоявшиеся в течение десятилетий
общепринятые представления, необходимо было проявить такую
исключительную активность в пропаганде своих результатов и
выводов, а также такую предприимчивость, которой Свим, повидимому, не обладал. Зато нашлись другие исследователи, которые
блестяще справились с этой задачей.
В 60-х и 70-х годах Л. Хейфлик опубликовал большую серию
научных и научно-популярных статей (см.. например: [Hayflick,
Moorhead, 1961; Hayflick, 1965; 1968; 1974; Хейфлик, 19691). посвященных
результатам длительного культивирования фибробластов человека.
Фактически эти статьи подтверждали результаты и выводы Свима. а
также концепцию Вейсманна, однако большинство читателей, не
знакомых с работами этих незаслуженно забытых авторов, восприняли публикации Хейфлика как принципиально новое научное
открытие . Поскольку публикации Хейфлика вызвали огромный интерес и получили широкую известность, ограничимся лишь кратким
изложением основных положений этих статей.
В своей знаменитой публикации [Hayflick, Moorhead, 1961, р. 600]
авторы пишут: "Обычная история штамма диплоидных клеток может
поэтому быть разделена на три отдельные фазы... Фаза I, или фаза
раннего роста, включает период, когда клетки освободились от
интактной ткани и только что расположились на стекле (первичная
культура)" . "Фаза I заканчивается формированием первого сомкнутого слоя, в этот момент культура готова к своему первому
пересеву и вступает в фазу II. Фаза II характеризуется быстрым
размножением клеток... В течение этой фазы диплоидные штаммы
должны пересеваться, по крайней мере, дважды в неделю с разве-
***
дением в отношении 2 или 3:1" . "Фаза II длится от 2 до 10 месяцев,
после чего начинает происходить клеточная дегенерация. Эта
дегенерация и снижение митотической активности знаменует появление фазы III. или терминальной фазы. Она характеризуется появ-
* Подобное восприятие статей Хейфлика было отчасти обусловлено их стилем: концепция Вейсманна о существовании предела клеточных делений излагалась без
упоминания ее автора, а иэ основополагающих работ Свима лишь однажды [Hayflick,
Moorhead, 1961] была вскользь упомянута одна [Swim, Parker, 1957], так что создается
впечатление принципиальной новизны всех полученных результатов и их интерпретации.
** Нетрудно заметить, что фаза I по классификации Хейфлика и Мурхеда соответствует начальному лагу фазы I по классификации Свима [Swim, 1959].
^* 4* Ф
Очевидно, что фаза II по классификации Хейфлика и Мурхеда соответствует фазе I
после начального лага по классификации Свима.
186

лением дебриса... снижением митотической активности и, следовательно, более длинным периодом времени, необходимым для
образования сомкнутых монослоев" . Кроме того, авторы отмечают, что «может происходить изменение... порождающее "клеточную линию", чья потенциальная продолжительность жизни бесконечна» [Hayflick, Moorhead, 1961, р. 587]. Нетрудно заметить, что это
"изменение" соответствует переходу культуры в фазу III по классификации Свима. Таким образом, многие принципиальные положения этой знаменитой и широко цитируемой статьи Хейфлика и
Мурхеда фактически являются повторением незаслуженно забытых
выводов Свима.
На основании приведенных результатов и ряда дополнительных
экспериментов был сделан вывод, что клетки человека способны
совершить лишь ограниченное, строго определенное число делений,
а затем гибнут. В соответствии с этой клеточной версией модели
шагреневой кожи человек в течение жизни неизбежно исчерпывает
заложенный в клетках потенциал делений и "момент, когда наступает
эта потеря, может определять предел продолжительности жизни
человека" [Hayflick, 1980, р. 42]. Действительно, "оказалось, что фибробласты эмбрионов человека в культуре делятся 50±10 раз: фибробласты, взятые от момента рождения до 20 лет, делятся 30±10 раз. а
клетки, взятые у доноров старше 20 лет, делятся 20±10 раз" [Хейфлик,
1969, с. 219]. Таким образом, почти через 100 лет исследователи
фактически вновь вернулись к некогда отвергнутой концепции
Вейсманна [Weismann, 1882], забыв, однако, ее автора.
Получило подтверждение и положение Вейсманна о том, что
клетки долгоживущих видов способны совершить больше делений.
Оказалось, что эмбриональные фибробласты мыши способны удвоить
свою численность in vitro всего 14—28 раз, цыпленка — 15—35, человека — 40—60. а черепахи — 72—114 раз [Hayflick, 1974].
Многочисленные публикации Хейфлика 60-х и 70-х годов были
восприняты многими как научная сенсация, открывающая принципиально новый подход к выяснению механизмов детерминации
продолжительности жизни. Поскольку работы Свима практически не
цитировались, статьи Хейфлика получили признание как первое и
окончательное опровержение мифа Карреля о неограниченной
способности клеток к делению. Поскольку и концепция Вейсманна о
пределе клеточных делений как основе старения также была
основательно забыта, статьи Хейфлика были восприняты как принципиально новая концепция, а не как возвращение к старой, первоначально выдвинутой гипотезе. Поэтому ограниченная способность
клеток к делению получила название лимита Хейфлика (см., например:
[Bremermann, 1982; Walford, 1983; Juckett, 1987]), а история открытия этой
Фаза III по классификации Хейфлика и Мурхеда точно совпадает с фазой II по
классификации Свима.
187

закономерности нередко излагается начиная лишь с работы Хейфлика
и Мурхеда [Hayflick, Moorhead, 1961].
Новая (точнее, хорошо забытая старая) концепция ограниченной
способности клеток к делению в настоящее время получила такую
известность и столь полное признание, что о ней можно теперь
прочитать даже в "Британской энциклопедии" [The New Encyclopaedia
Bntanmca, 1989, vol. 1, p 148]. "Лабораторные эксперименты показали,
что клетки, взятые из сложных организмов, проходят лишь ограниченное число клеточных делений до своей гибели, подтверждая
идею, что клеточные события могут вызывать старение" Габоты же
Хейфлика, подтверждающие эту концепцию, стали рассма1риваться
как пример научной революции в биологии [Witkowski, 1987]. Здесь,
казалось бы, пришло самое время поставить точку в этой длинной
истории со счастливым концом, однако есть серьезные основания
считать, что она еще не закончилась
В 1978 г нами была проведена ревизия концепции Вейсманна—
Свима—Хейфлика. в результате которой были сделаны следующие
выводы [Гаврилов, Гаврилова, 1978, Гаврилов, Ягужинская, 19781
1 Массовая гибель клеток в фазе II по Свиму или в фазе III по
Хейфлику — это методический артефакт, обусловленный повреждением клеток в результате процедуры пересева (обработка клеток
трипсином и их последующее суспендирование) Если же оценить
вероятность гибели клеток вне периодов пересева, то оказывается,
что вероятность смерти клеток не увеличивается с возрастом культуры, т е нет оснований говорить о старении на клеточном уровне
2 Основное содержание феномена Свима—Хейфлика in vitro — это
накопление в культуре постмитотических клеток, полноценных в
метаболическом отношении Процесс образования этих метаболически полноценных постмитотических клеток больше напоминает
дифференцировку клеток, чем их повреждение и старение К этому же
выводу одновременно с нами пришли и другие исследователи [Bell ct
al, 1978].
3 Накопление в культуре постмитотических клеток не сопровождается уменьшением абсолютного числа делящихся клеток в
расчете на всю образующуюся клеточную популяцию Иначе говоря,
происходит не исчезновение делящихся клеток, а лишь разбавление
культуры постми готическими клетками Следовательно, нет никаких
оснований говорить об ограниченной способности к делению всех
клеток в культуре Напротив например, в культуре эмбриональных
фибробластов человека имеются клетки совершающие около 170 делений (вместо общепринятых 50) и обладающие свойствами стволовых
клеток с неограниченной способностью к делению
Теперь рассмотрим сделанные выводы несколько более подробно,
для чего обратимся к анализу методики культивирования клеток,
состоящей в следующем Образец ткани (например, кожи) помещают в
сосуд с культуральной средой и ждут, когда из этого первичного
эксплантата часть клеток мигрирует на поверхность флакона и
188

размножившись, образует сомкнутый монослой, покрывающий дно
сосуда Никто не знает при этом, сколько клеток мигрирует из
трансплантата и сколько делений они совершают По мнению Голдштейна и соавторов, эта процедура соответствует примерно 10
удвоениям популяции [Goldstein et al., 1975]. В случае же эмбриональной ткани легкого ее обрабатывают трипсином, и суспендированные клетки пересевают в сосуд с питательной средой [Hayflick,
1968] После того как культура клеток образует монослой, ее
пересевают, обрабатывая 0 1Х-ным раствором трипсина, суспендируя и перенося желаемое число клеток в новые сосуды с
питательной средой Пересев в отношении 1 2 означает, что только
половина клеток, образовавших сомкнутый монослой, пересевается в
сосуд с той же поверхностью Когда и в этом сосуде в результате
деления клеток образуется монослой, считают, что произошло
удвоение клеточной популяции, соответствующее в среднем одному
делению клеток Подобную операцию повторяют многократно (в
случае эмбриональных фибробластов человека около 50 раз), до тех
пор, пока культура не потеряет способности к быстрому восстановлению своей численности Теперь попытаемся оценить число
делений, которое совершают клетки Известно, что через сутки после
операции пересева в живых остается только 50—70Х клеток
'молодых" культур и лишь 25Х клеток "старых" культур (эти клетки
являются более крупными и сильнее всего повреждаются при
суспендировании) [Гаврилов, Гаврилова, 1978, 1982]* Таким образом.
40—60 пересевов соответствуют не 40—60 удвоениям популяции, а
80—120 удвоениям, которые совершают выжившие клетки Далее, одно
удвоение клеточной популяции соответствует одному делению
клеток лишь в том случае, если все клетки способны делиться На
самом же деле доля делящихся клеток сильно уменьшается при
культивировании и к последнему пересеву составляет всего 10—20Х
[Там же] Можно показать, что в том случае, когда только 10Х клеток
сохраняет способность к делению, им необходимо поделиться 10 раз,
чтобы численность всей культуры удвоилась [Гаврилов, Ягужинский,
1978, Гаврилов, Гаврилова, 1982] Если учесть это обстоятельство, то
окажется, что 80—120 удвоений численности клеток соответствуют
170±30 делениям Итак, оказывается, что 50 пересевов клеток человека соответствует не 50, а 170±30 делениям
Самое главное, однако, состоит в том, что и это число делений
оказывается не окончательным Дело в том, что гибель клеточной
культуры определяется весьма своеобразно Оказывается, культуру
клеток называют мертвой лишь потому, что в течение произвольно
заданного интервала времени (обычно от одной до четырех недель)
Такое массовое разрушение клеток при пересеве в сочетании с низкими темпами
восстановления численности "старых" культур и порождало иллюзию естественной
массовой дегенерации и гибели клеток описанную в ряде работ [Swim, 1959,
Hayflick. Moorhead, 1961, Hayfhck, 1968]
189

ее численность не возрастает до желаемой величины (обычно
задается численность, в два-четыре раза превышающая исходную) .
Более того, в "мертвых" культурах еще остается 10—20Х клеток,
способных делиться, поэтому культура может компенсировать
естественную гибель клеток (которая, кстати, не увеличивается) и
даже медленно расти [Гаврилов, Гаврилова, 1978; 19821. Оказалось
также, что абсолютное число делящихся клеток в расчете на всю
образующуюся клеточную массу не уменьшается, а происходит лишь
их разбавление неделящимися клетками. В результате, когда доля
делящихся клеток становится близка к 10Х. культура действительно
не может расти столь быстро, чтобы ее считали живой. Таким
образом, феномен "гибели" культуры клеток не только не эквивалентен гибели клеток, но даже не означает того. что все клетки
культуры имеют ограниченную способность к делению. В результате
проведенных исследований нами был сделан вывод, что в культуре
клеток происходит их дифференцировка с образованием неделящихся клеток, но некоторые клетки культуры являются стволовыми и
могут размножаться неограниченно [Гаврилов, Ягужинский, 1978].
Некоторые из сделанных нами выводов были одновременно и
независимо подтверждены другими авторами [Belletal., 1978, р. 1160]:
"...одной из наименее документированных особенностей гипотезы
старения in vitro является общепринятое утверждение о том, что
клетки в фазе 3 являются нежизнеспособными и в конце концов
погибают. Это утверждение не имеет никакого серьезного экспериментального подтверждения ...Наш опыт свидетельствует о том.
что сам по себе пересев неизбежно приводит к потере клеток. ...Мы
наблюдали выживаемость фибробластов крайней плоти (штамм 1519) в
культуре в течение длительного периода после того, как клеточное
деление прекращалось. Наши первые культуры клеток штамма 1519
поддерживались живыми в среде Хэма ...в течение 22 месяцев и в
течение периода от года до 14 месяцев после прекращения клеточных делений ...Биохимические исследования показали, что, несмотря на то что клетки фазы 3 отличаются в некоторых отношениях
от клеток фазы 2, они, по существу, нормальны. ...Сообщения о биохимических различиях между клетками в фазе 2 и фазе 3 отражают
различия в дифференцировке, а не в возрасте»**.
Впоследствии и сам Л. Хейфлик совместно с Т. Матсумурой и
3. Зеррудо [Matsumura et al., 1979] подтвердил отсутствие массовой
гибели клеток в фазе III по его классификации. Авторы этой работы в
В качестве примера приведем следующее определение: "Культуры считались мертвыми, когда они не могли достигнуть сомкнутого монослоя после 4 недель при
еженедельной смене среды" [Goldstein, Singal, 1974, р. 360).
**
Фазы 2 и 3 в данной статье соответствуют классификации Хейфлика, а не Сейма Повидимому, авторы данной статьи, так же как и многие другие исследователи,
просто не знакомы с основополагающими работами Сейма и поэтому его статей не
цитируют.
190


Рис. 54. Первоначальная версия поведения диплоидных фибробластов человека в
культуре согласно работе [Hayflick, Moorhead, 1961]
На рисунке изображено увеличение числа клеток по мере их культивирования (фазы
I и II), за которым следует резкое уменьшение числа клеток (фаза III). Данный рисунок,
впервые опубликованный в 1961 г., постоянно воспроизводился в научных и научнопопулярных изданиях (см.: например: Hayflick, 1966; 1968; 1977; 1982] и приведен в
учебнике по биологии старения [Лэмб, 19801
течение шести месяцев поддерживали "мертвые" культуры, некоторые
из которых за это время в 16 раз увеличили свою численность.
Никаких признаков приближающейся массовой гибели клеток
обнаружить не удалось, хотя срок наблюдения за "мертвыми" культурами иногда превышал даже год (для сравнения отметим, что вся
предшествующая процедура 50 пересевов занимает обычно шестьвосемь месяцев) [Hayflick, 1968].
В результате этих исследований Хейфлик изменил свое представление об ограниченной продолжительности жизни клеточных
культур. Первоначально он излагал свои результаты следующим
образом (рис. 54): "Мы обнаружили, что фибробласты, взятые от
четырехмесячного человеческого эмбриона, удваивались таким
образом в числе в среднем 50 раз (от 40 до 60). Истощив свою
способность к делению, клетки гибли" [Hayflick, 1968, р. 35]. В работе
1979 г. приведена уже принципиально иная схема (рис. 55) и все
излагается иначе: "В ранней фазе III культура еще пролиферирует,
хотя скорость пролиферации снижается. В последней фазе III
клеточная пролиферация очень низка... В течение этого периода не
наблюдалось ни признаков окончательной смерти культуры, ни
спонтанного приобретения неограниченного пролиферативного
потенциала" [Matsumura et al., 1979, р. 332, ЗЗЗ]. Следует подчеркнуть,
что изменение позиции исследователя делает ему честь как ученому,
поскольку цель науки состоит не в отстаивании догматов, а в поиске
истины. Однако достойно сожаления то, что вскрывшаяся истина
191


Рис 55 Новая пересмотренная версия поведения диплоидных фибробластов человека
в культуре согласно [Matsumura et al., 1979]
На рисунке изображено увеличение числа клеток по мере их культивирования (фазы
I и II), за которым следует постепенное снижение темпов их роста (ранняя и поздняя
фазы III) В отличие от первоначальной версии (рис 54), данная, более правильная
схема Хейфликом не рекламировалась и известна лишь узкому кругу специалистов
стала известна лишь очень узкому кругу специалистов, а в таких
ведущих научно-популярных журналах, как "Scientific American",
продолжалась реклама старой легенды, что "в конце концов клетки

<< Предыдущая

стр. 32
(из 45 стр.)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Следующая >>